[发明专利]一种CRISPR/Cpf1系统介导的以RNA转录本为修复模板的同源重组方法

摘要

本发明公开了一种CRISPR/Cpf1系统介导的以RNA转录本为修复模板的同源重组方法。本发明以水稻ALS基因为研究对象，构建了同源重组载体。将RCR1‑RCR2‑RDR片段进行体外转录，通过RNP方法，以RNA转录本作为修复模板，在水稻愈伤中实现了目的基因的同源重组修复。同时，利用基因枪方法将载体导入水稻愈伤中，获得了ALS基因定点修饰的水稻植株。结果表明，以RNA作为修复模板可成功介导目的基因的同源重组，为农作物育种提供了新思路，因此在农业育种方面具有强大的应用潜力。

主权项

1.一种用于取代植物基因组中的目标片段的表达盒甲，包括启动子甲和终止子，其特征在于：在启动子甲和终止子之间包括如下三个区段：区段Ⅰ、区段Ⅱ和区段Ⅲ；区段Ⅲ为区段Ⅲ‑1或区段Ⅲ‑2；区段Ⅰ中具有两个核酸酶的编码序列和一个位于它们之间的crRNA1的编码序列；区段Ⅱ中具有两个核酸酶的编码序列和一个位于它们之间的crRNA2的编码序列；区段Ⅲ‑1中具有两个核酸酶的编码序列和位于它们之间的模板区段；区段Ⅲ‑2中具有两个靶标序列和位于它们之间的模板区段；所述模板区段包括上游同源臂、供体片段序列和下游同源臂；所述目标片段的一个末端为区段Ⅰ中crRNA1的靶标序列，另一个末端为区段Ⅱ中crRNA2的靶标序列；供体片段与目标片段具有如下差异：①预期在目标片段中引入的差异核苷酸；②将crRNA1的靶标中的TTTN突变为非TTTN；③将crRNA2的靶标中的TTTN突变为非TTTN。