[发明专利]一种利用CRISPR/LbCpf1系统实现目的基因在植物中同源重组的方法

摘要

本发明公开了一种利用CRISPR/LbCpf1系统实现目的基因在植物中同源重组的方法。本发明以水稻ALS基因为研究对象，构建了同源重组载体。载体甲采用OsU3作为启动子，启动crRNAs的转录，且载体中的修复模板只含有左侧同源臂。载体乙同样采用OsU3作为启动子，启动crRNAs的转录，但载体中的修复模板含有两个同源臂。利用基因枪方法将载体与外源片段同时转入水稻愈伤中，获得了ALS基因定点修饰的水稻植株。研究结果一方面表明，当双链DNA作为修复模板时，细胞采用SDSA模型进行同源重组修复，且当修复模板中只含有左侧同源重组臂时同样可成功介导目的基因的同源重组，此策略使得载体构建更为简单。

主权项

1.一种用于取代植物基因组中的目标片段的重组载体，包括如下元件甲、元件乙和元件丙；所述元件甲包括启动子甲、区段Ⅰ和区段Ⅱ；区段Ⅰ中具有两个核酸酶的编码序列和一个位于它们之间的crRNA1的编码序列；区段Ⅱ中具有两个核酸酶的编码序列和一个位于它们之间的crRNA2的编码序列；所述元件乙为表达盒；所述表达盒中由启动子乙启动LbCpf1核酸酶的编码基因表达；所述元件丙为元件丙‑1或元件丙‑2；所述元件丙‑1中具有两个靶标序列和位于它们之间的模板区段A；所述模板区段A包括上游同源臂和供体片段序列；所述元件丙‑2中具有两个靶标序列和位于它们之间的模板区段B；所述模板区段B包括上游同源臂、供体片段序列和下游同源臂；所述目标片段的一个末端为区段Ⅰ中crRNA1的靶标序列，另一个末端为区段Ⅱ中crRNA2的靶标序列；供体片段与目标片段具有如下差异：①预期在目标片段中引入的差异核苷酸；②将crRNA1的靶标中的TTTN突变为非TTTN；③将crRNA2的靶标中的TTTN突变为非TTTN。