[发明专利]一种鸭卵巢卵泡膜层细胞的分离培养方法

摘要

本发明公开了一种鸭卵巢卵泡膜层细胞的分离及培养方法，其分离及培养方法如下：将鸭颈部放血处死，取出卵巢，用磷酸盐缓冲液冲洗血污；剥离卵泡外层结缔组织与血管网；在卵泡柄对面无血管区域划开卵泡，倒出、洗净卵黄与颗粒细胞，仅保留膜层细胞；胰蛋白酶水浴消化；加入胎牛血清终止消化，并用磷酸盐缓冲液反复清洗；剪碎组织，用胶原酶等消化液水浴消化；使用冰冷磷酸盐缓冲液冲终止消化；过滤，离心，使用含10％胎牛血清的改良杜氏伊格尔培养基重悬细胞液；接种至细胞培养皿中；培养6h换液，置于培养箱继续培养。本发明获得的鸭卵巢卵泡膜层细胞纯度高，贴壁紧密，细胞形态正常，活性良好，培养方法稳定可靠，可重复性强。

主权项

1.一种鸭卵巢卵泡膜层细胞的分离及培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1)选取健康的产蛋期连城白鸭母鸭颈部放血处死，用75％酒精棉擦拭干净后剪开腹部皮肤取出卵巢及卵泡，PBS缓冲液冲去血污，将干净的卵巢卵泡放入装有PBS缓冲液的烧杯中，迅速转入细胞培养室中；2)取出卵巢组织，将等级卵泡取出，剥净外层的结缔组织和血管网，用PBS缓冲液洗净血污放入装有PBS缓冲液的培养皿；3)沿卵泡表面柄对面的无血管区划开1～2cm小口，去除卵黄及颗粒细胞后将卵泡膜层反转，在PBS缓冲液中反复清洗，直至卵黄及颗粒细胞被洗尽；4)加入胰蛋白酶消化液，在37℃水浴中振荡孵育10min后，加入胎牛血清终止消化，用PBS缓冲液洗净胰蛋白酶消化液；5)将膜层组织剪碎，加入酶消化液，转入37℃水浴中振荡孵育20min；6)使用PBS缓冲液稀释酶消化液，转移含膜层细胞的酶消化液过不锈钢细胞网筛，并用PBS缓冲液冲洗网筛；7)将细胞液转移至离心管，以800g离心10min，弃去上清液，使用改良DMEM培养液将细胞重悬后分装，放入培养箱中培养；8)用75％的酒精棉将培养板擦拭干净，置于37℃含5％CO2培养箱恒温培养，6h后弃去含血细胞的上清液，置于培养箱继续培养。