[发明专利]一种食源性致病菌现场快速检测方法

摘要

本发明涉及一种食源性致病菌现场快速检测方法，纳米FRET探针合成：利用高温共沉淀法合成上转换荧光纳米微粒AReF4:Yb,Er，利用偶联剂EDC、sulfo‑NHS将AReF4:Yb,Er与待检测食源性治病菌的适配体、适配体的互补寡核苷酸单链cDNA与Alexa Fluor 546荧光染料分别进行共价偶联，并将两种偶联产物共孵育得到纳米FRET探针。该发明构建AReF4:Yb,Er‑Aptamer/cDNA‑Alexa Fluor 546纳米FRET探针的方法工艺简单，建立的定性检测方法快速、简便，定量检测方法快速、灵敏度高、特异性强。该发明适用于食源性致病菌现场快速检测领域，对食品安全的控制具有积极意义。

主权项

1.一种食源性致病菌现场快速检测方法，其特征在于：步骤一、筛选得到常见食源性致病菌适配体，测定适配体与靶标的特异性和亲和力，拟合解离常数曲线；并合成与适配体对应的互补寡核苷酸单链；步骤二、利用高温共沉淀法，获得AReF4:Yb,Er上转换荧光纳米微粒；步骤三、利用配体交换法在UCNPs表面修饰氨基，获得氨基修饰的UCNPs，使用无水乙醇和去离子水洗涤2‑4次；步骤四、利用EDC/Sulfo‑NHS作为偶联剂，先活化致病菌适配体的羧基端30‑60 min，再加入适量氨基修饰的UCNPs，室温搅拌16‑24 h；离心、洗涤得到Aptamer‑UCNPs纳米探针；采用相同的方法将与适配体对应的互补寡核苷酸单链与AF546荧光染料进行共价偶联得到AF546‑cDNA；步骤五、将一定量Aptamer‑UCNPs纳米探针和AF546‑cDNA加入到1‑3 mL杂交缓冲液中，室温搅拌20‑60 min，通过碱基互补配对获得AF546‑cDNA/Aptamer‑UCNPs纳米复合物；使用980 nm便携式半导体激光器激发纳米复合物溶液，利用普通数码相机拍照记录纳米复合物荧光发光图片；利用荧光光谱仪测定纳米复合物荧光光谱，分别积分计算510‑560 nm、640‑680 nm波段的荧光强度G510‑560和R640‑680，得到两个波段的荧光强度比值GRR=G510‑560/R640‑680。