[发明专利]菊芋实时定量PCR分析中内参基因的选择方法

摘要

本发明公开了一种菊芋实时定量PCR分析中内参基因的选择方法，涉及定量PCR领域，该方法以菊芋不同组织(幼根、嫩茎、叶、茎块和花瓣)为材料，使用q PCR技术开展18S核糖体RNA基因(18S rRNA)、转录延伸因子基因(Ef‑1a)、肌动蛋白基因(Actin、β‑actin)、3‑磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)、25S核糖体RNA基因(25S rRNA)、多聚泛素酶基因(UBQ)7内参基因的表达量分析，并利用GeNorm和NormFinder软件对所获得的数据进行统计学上的评估，分析各看家基因的表达变化，以期筛选出相对稳定的基因作为菊芋的内参基因，用于研究菊芋基因量的变化。

主权项

1.一种菊芋实时定量PCR分析中内参基因的选择方法，其特征在于：所述菊芋实时定量PCR分析中内参基因的选择方法的步骤如下：(1)总RNA的提取：称取100mg菊芋叶片或块茎组织放入预冷好的研钵中，在液氮中快速研磨成粉状后移至盛有1mL Trizol的1.5mL无酶离心管中，将匀浆样品在室温下，放置5min，加200ul氯仿，盖好管盖，在涡旋振荡器上剧烈震荡15sec左右，然后室温静置3min，12000r·min‑14℃离心10min，样品会分成三层，将上层透明的水相(500ul)转移到新的无酶离心管中，加入500ul的异丙醇，混匀后在室温下放置20min，12000r·min‑14℃离心10min，去上清，沉淀用1mL75％的乙醇洗涤2次，短暂离心后倒出液体，晾干后加入30uL RNase·Free ddH2O，吹打混匀，之后用TGem Plus全波长分光光度计测定总RNA的浓度和纯度，再用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整度；(2)反转录c DNA第一链的合成：按照M‑MuLV第一链cDNA合成试剂盒的操作方法，将各样品总RNA反转录合成cDNA第一链，反转录体系为20μL，获得的cDNA产物直接用于PCR或‑80℃贮藏备用；(3)PCR引物设计：根据定量PCR引物的设计原则，利用Primer Premier 5.0软件，分别设计18S rRNA、Eef‑1a、Actin、β‑actin、GAPDH、25S rRNA和UBQ57个内参基因的定量PCR引物，引物序列见表1，由华大基因科技有限公司合成，内参基因的荧光定量PCR分析以菊芋不同组织来源的第1链为cDNA模板，进行实时荧光定量分析，在八连管中加入2×SuperPeal PreMix Plus10μL，上、下游引物(10μmol·L‑1)各0.6μL，cDNA模板1μL，RNase‑free ddH2O加至20μL，每个样品重复3次，反应条件为：95℃预变性15分钟；95℃变性10秒，53℃退火20秒，72℃延伸30秒，40个循环；72℃延伸10分钟，采集融解曲线荧光信号，数据由荧光定量PCR仪自动读取，每个样品重复3次；(4)数据分析：对荧光定量PCR仪读取的各个样品CT值(表达量越高，CT值越小)，用公式Q＝EΔCT进行计算，得出各基因的相对表达量Q值，其中E是基因的扩增效率，一般情况下，2为默认理想扩增效率，ΔCT＝CTmin‑CT样品(CTmin为所以样品里最小的CT值，CT样品为各个样品的CT值，软件GeNorm和Norm‑ Finder分析各基因的稳定性。