[发明专利]菊芋EST-SSR分子标记开发及应用

摘要

本发明公开了一种菊芋EST‑SSR分子标记开发及应用，涉及分子标记领域，该菊芋EST‑SSR分子标记开发以45份菊芋品种为材料，旨在通过对菊芋EST数据库中SSR信息进行分析，发掘SSR位点探明其规律，并开发EST‑SSR标记并分析其多态性，目的是为开发与利用菊芋EST资源、丰富菊芋分子标记类型，为遗传多样性分析、功能基因的发现与定位、种质资源鉴定等方面的应用与研究提供技术支持和理论依据；并为下一步进行菊芋特异基因片段的克隆、核心资源构建以及抗性评价提供依据。

主权项

1.一种菊芋EST‑SSR分子标记开发及应用，其特征在于：所述菊芋EST‑SSR分子标记开发及应用采用EST‑trimmer程序去除带有Poly A或者Poly T结构的序列，并截去片段太低的低质量序列，使用Cap3软件对EST序列进行拼接和聚类，然后通过MISA脚本对拼接后的结果进行SSR位点搜索，查找的标准设定为：最低片段18bp，即单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的最少重复次数分别在18、9、6、5、4、3次以上，与此同时，将间隔小于或等于10bp的被打断的不完全重复SSR位点也列为搜索对象，将生成的文本格式文件导入Excel表中，对EST‑SSRs的基本信息进行统计分析。引物设计选择SSR位点的重复单元为二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸最少重复次数分别为8次、6次、4次、3次、3次，且SSR位点距离序列两端大于50bp的序列；利用Primer5设计引物，引物设计的主要参数：引物长度控制在17～24bp，预期产物长度控制在150～400bp，设计出来的引物利用Oligo软件进行引物评估，避免引物二聚体、发夹结构和错配等情况的发生，将96对通过评估的EST‑SSR引物合成，引物最佳复性温度的筛选于Mastercycler Pro梯度PCR仪上进行，PCR反应体系为20μL，其中包括：1×Buffer，1.5mmol·L‑1 MgCl2，0.2mmol·L‑1 dNTPs，0.25mmol·L‑1的上下游引物，1.0U的DNA polymerase，以及4.5ng的DNA模板，反应程序为94℃预变性5min，然后进行35个循环，每个循环包括94℃变性45s，复性(55～60℃)30s，72℃延伸2min，最后72℃延伸10min，PCR反应产物利用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶于DYY‑II型垂直板电泳仪及DYC‑30型电泳槽中电泳分离，上样完毕后在200V与100mA条件下电泳180min，电泳结束后银染法染色，在相同迁移率位置上，有带记为1，无带记为0，用SSR出现频率和SSR平均分布距离来描述EST‑SSR，计算公式为：(1)SSR出现频率，fc＝c/n×100％，c为搜索到的SSR数量，n为无冗余EST数量；(2)SSR平均分布距离，fN＝N/c，N为无冗余EST数量的总碱基数。