[发明专利]哌拉西林单克隆抗体的制备方法及应用

摘要

本发明涉及一种哌拉西林单克隆抗体的制备方法及其应用，利用杂交瘤细胞株制备，制备方法包括哌拉西林单克隆抗体的制备、抗体纯化、抗体纯度鉴定、抗体效价鉴定。所制备的哌拉西林单克隆抗体用于哌拉西林药物抗体检测，以被检测对象血液作为检测样品，若血浆中存在哌拉西林抗体，则该抗体通过抗IgG+C3d桥连与哌拉西林处理细胞上的哌拉西林药物抗原结合产生凝集，在离心力的作用下不能通过凝胶间隙而留在凝胶上层或分散在凝胶中，呈现阳性反应；若血浆中不存在抗体或细胞表面不含有药物抗原则不产生凝集，在离心力作用下可通过凝胶间隙而沉积在微柱凝胶孔的底部，呈现阴性反应。

主权项

1.一种哌拉西林单克隆抗体的制备方法，其特征在于：利用杂交瘤细胞株制备，具体步骤如下：1.1饲养细胞的制备：取6‑10周龄Balb/c小鼠，拉颈处死，浸泡于酒精内，消毒3‑5min；转入无菌操作台中，用无菌剪刀剪开皮肤，使其腹膜充分暴露；用无菌注射器注入预冷的无血清1640培养液，用轻轻拍动小鼠腹腔，吸出培养液，放入离心管，离心；弃掉上清，用完全培养液重悬饲养细胞，计数，并调整细胞数至2×105个/mL，将饲养细胞加入96孔板中，每孔100μL，然后放入37℃的CO2培养箱培养；1.2杂交瘤细胞融合及有限稀释法亚克隆筛选a.制备免疫B细胞：将免疫后的小鼠摘眼球放血，收集血液后处死；无菌分离取出小鼠脾脏置于含有无血清1640培养液的平皿中，以无血清1640培养液润湿铜网，在培养皿中碾碎脾脏并以铜网过滤制备B细胞悬液，补充无血清培养液体积至40mL；将B细胞悬液离心，弃上清；重复以上步骤，再洗一次；b.制备骨髓瘤细胞：取培养与250mL培养瓶中的对数生长期骨髓瘤细胞SP2/0细胞1‑2瓶，吹打细胞调整体积至40mL，转入50mL无菌离心管中，离心，弃上清，重复以上步骤，再洗一次；c.按照1/10—1/5的比例混合SP2/0骨髓瘤细胞与免疫B细胞，补加不完全1640培养液至40mL，1000r/min离心10min清洗一次；d.倾出上清液，吸净残留液体，轻弹管壁，使细胞疏松呈糊状；e.将含融合细胞的离心管置于37℃水浴，吸取0.8mL 37℃预温的PEG 4000，缓慢滴入管内，边加边旋转，60s内滴完，37℃静置90s以上；f.然后5min内加入10mL 37℃预温的不完全培养基，第一分钟加1mL、第二分钟加1mL、第三分钟加1.5mL、第四分钟加1.5mL、第五分钟加完、最后补至30mL，于37℃静置5min，1000r/min离心6min；弃掉上清，缓慢加入20mL完全培养液，轻柔搅拌混匀后补足完全培养液至40mL，加入1×HAT培养基，分至4板已铺好饲养细胞的96孔板中，未加融合细胞的孔为阴性对照；g.5天后每孔补充50μL含1×HT培养基的完全培养液；h.当融合细胞，铺满1/4孔底时，不需换液，直接通过IELISA检测杂交瘤细胞抗体分泌情况；i.对得到的阳性孔进行复查和亚类鉴定，复查阳性并且亚类为IgG的细胞株用有限稀释法进行克隆化筛选，计数200个细胞以梯度铺板法铺于一块96孔板；j.根据后续ELISA检测结果，进行3‑5次克隆化筛选，至所有有细胞的孔均为阳性，则得到单克隆杂交瘤细胞株，进行扩大培养；k.将抗体分泌阳性的克隆转入24孔板，进一步转种入培养瓶中扩大培养，冻存部分克隆细胞，同时进行克隆化培养；l.用IELISA方法对杂交瘤细胞培养上清进行交叉筛选；m.制备饲养细胞层100μL/孔，2×104个/孔，用无菌吸管吹打培养板中的克隆，悬浮于完全培养液，调整细胞浓度至10‑20个/mL，加1×HT培养基，加入含饲养细胞的培养板中，100μL/孔，使每孔含有1‑2个细胞，在培养箱中培养8‑12天，当杂交瘤细胞铺满1/4孔底时，取上清检测；阳性孔再进行克隆化培养至100％克隆分泌特异性抗体为止，大量扩大培养，并标记好冻存于液氮罐中，记录冻存位置。