[发明专利]一种蓖麻原生质体制备和转化方法

摘要

本发明公开了一种蓖麻原生质体制备和转化方法。本发明通过优化蓖麻叶片原生质体分离制备中叶片材料获取时间、切取叶片的形状、酶浓度、酶解时间和离心转速等，并利用自制的简易装置过滤，获得更多活力较强的原生质体，并利用本发明的方法成功的将外源质粒转化蓖麻叶片原生质体，可以用于进一步的亚细胞定位。本发明为蓖麻功能基因的分析建立了一套高效的蓖麻叶片原生质体制备和转化方法及亚细胞定位体系，利用这套体系可以高效的获得蓖麻叶片原生质体，为获得进行亚细胞定位提供了前提条件，进一步为蓖麻关键功能基因研究奠定了良好的工作基础，为蓖麻原生质体的应用提供技术支持。

主权项

1.一种蓖麻原生质体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a.利用完整的种子幼胚培养蓖麻无菌苗，培养20天后，取叶片并吸干表面水分，舍去主叶脉部分，把叶片切成0.2mm宽细丝，然后将其浸没于W5溶液中，加入酶解液，25℃、50rpm振荡酶解80min；所述的酶解液，含有16g/L的纤维素酶RS、8g/L的离析酶R‑10、0.5M的甘露醇、20mM MES、10mM CaCl2和1g/L的BSA，余量为水；b.去掉酶解液，然后加入W5溶液漂洗酶解后的叶片细丝，收集漂洗后的溶液，利用原生质体过滤装置过滤，收集过滤液，700rpm离心5min，倒去上清液，用W5溶液悬浮原生质体，再700rpm离心5min，倒去上清液，用W5溶液悬浮原生质体，再700rpm离心10min，去上清，沉淀即为蓖麻原生质体。