[发明专利]MiR-210在胶质瘤中相关靶点验证的实验方法

摘要

本发明公开了MiR‑210在胶质瘤中相关靶点验证的实验方法，其特征为，括如下步骤：利用胶质瘤细胞系，分别构建miR‑210过表达细胞组、miR‑210低表达细胞组及空质粒细胞组，通过real‑time qPCR，western blotting实验检测miR‑210对下游基因的影响程度，检测靶点蛋白和其基因的表达水平。并通过MTT、侵袭、迁移等试验明确miR‑210的相关生物学作用。并且通过报告基因明确靶点是否正确。

主权项

1.MiR‑210在胶质瘤中相关靶点验证的实验方法，其特征为，括如下步骤：1)质粒构建、细胞模型的建立：标准好miR‑210mimics、inhibitors以及空白miRNA‑FITC，U251和U87‑MG胶质瘤细胞系分别培养至24孔板，转染前2小时换无血清培养基，用脂质体2000包裹质粒后转染入细胞，6小时后换液，24小时后荧光显微镜下观察FITC表达，通过对比可见光视野和荧光视野计算转染效率，密切观察细胞生长状况及活力；第1天，将另一组细胞分别抽取约1×105细胞滴至35mm孔板，2‑4天每天换液；通过上述处理，建立miR‑210过表达细胞系、miR‑210低表达细胞系、空白质粒细胞系以及空白对照细胞系；2)荧光定量RT‑PCR：将待测各组细胞系抽提总RNATrizol，Invitrogen，抽取50μl总RNA，紫外分光光度计计算浓度和纯度，当OD A260/A280比值在1.8‑2.0之间时，才被认为提取的RNA纯度符合要求，琼脂糖电泳观察RNA完整性，再进行荧光定量RT‑PCR反应，确保提取的RNA的纯度和浓度，采用PrimeScript RT reagent Kit进行逆转录得到cDNA，利用PCR试剂盒及合成的靶点蛋白PCR引物进行PCR观察靶点在细胞系中的表达水平，重复试验3次；3)蛋白印迹法检测蛋白表达：实验细胞系经裂解后提取总蛋白，离心后取上清液进行SDS‑PAGE电泳，阳极碳板100V，1h转PVDF膜，封闭后加一抗孵育，抗体封闭、漂洗，再加二抗孵育，ECL底物显色，X‑光片曝光显影，GAPDH作为对照，观察转染后靶点蛋白表达量，重复试验3次；4)流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡及增值情况：将实验组细胞系分别用0.25％胰酶消化，经水平离心机2000RPM，离心15min，收集细胞，弃培养基，冷PBS洗涤细胞两次；用400μl1*Binding Buffer悬浮细胞，浓度大约5*10cells/ml；在细胞悬浮液中加入5μl Annexin V‑FITC,轻轻混匀后于2‑8℃避光条件下15min，加入10μl PI后混匀于2‑8℃避光条件下孵育5min；冷PBS稀释至2ml，流式细胞仪设置激发波长488nm，首次实验需分析经Annexin V、PI分别单染的细胞来调节荧光补偿去除光谱重叠，根据未处理细胞空白对照和经Annexin V、PI分别细胞染色后的单染对照的分析设定标准，上机重复试验3次；5)侵袭实验：把miR‑210过表达组、miR‑210低表达组、空白质粒细胞系以及空白对照组分别放入6孔培养皿进行培养，培养皿两侧分别接种细胞，进行划痕，继续培养直到培养皿中两边细胞有80％‑90％的融合，分别取0h和24h各组融合情况的图片，应用公式[融合率＝(宽度0h‑宽度24h)/宽度0h×100％]计算融合率；6)细胞迁移实验：在Transwell上室的聚碳酸酯膜上先加入Matrigel：DMEM为1：2稀释后Matrigel60μl，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶，在Transwell下室中加入趋化因子细胞培养液600μl；待检细胞无血清培养液制成单细胞悬液，在室孔中加人l×105个细胞，细胞悬液体积100～200μl，每组细胞平行做三孔；置于5％CO2培养箱于37℃培养12h，取出上室，弃去上室液体，用湿棉签擦去膜上面未穿过膜的细胞，苏木精染色，冲洗干净后Clearmont双侧封片，80℃烤干，倒置显微镜下直接观察穿过膜的细胞，每张膜中央和周围部分各随机取3个视野，计数每个视野内的穿过8μm微孔的细胞数；7)报告基因构建靶点蛋白的报告基因质粒，将报告基因质粒与目的质粒一起转染入试验细胞，将报告基因细胞裂解液充分混匀，加入报告基因细胞裂解液，充分裂解细胞，充分裂解后，10000‑15000g离心3‑5分钟，取上清用于测定，融解萤火虫荧光素酶检测试剂和Renilla荧光素酶检测缓冲液，并达到室温，Renilla荧光素酶检测底物置于冰浴或冰盒上备用，按照每个样品需100微升的量，取适量Renilla荧光素酶检测缓冲液，按照1:100加入Renilla荧光素酶检测底物配制成Renilla荧光素酶检测工作液，按仪器操作说明书开启荧光测定仪，将测定间隔设为2秒，测定时间设为10秒，在完成上述测定萤火虫荧光素酶步骤后，加入100微升Renilla荧光素酶检测工作液，用枪打匀或用其它适当方式混匀后测定RLU，在以Renilla荧光素酶为内参的情况下，用萤火虫荧光素酶测定得到的RLU值除以Renilla荧光素酶测定得到的RLU值，查看目的蛋白的转录活性。