[发明专利]一种基于基因改造益生菌表达外源药物的方法及其应用在审
| 申请号： | 201810530613.4 | 申请日： | 2018-05-29 |
| 公开（公告）号： | CN108660148A | 公开（公告）日： | 2018-10-16 |
| 发明（设计）人： | 陈卫华;刘智;陈国忠;任杨柳 | 申请（专利权）人： | 奇元科技（武汉）有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/90;C12N1/21;A61K39/00;A61P35/00 |
| 代理公司： | 南京纵横知识产权代理有限公司 32224 | 代理人： | 徐瑛 |
| 地址： | 430000 湖北省武汉市东湖新技术*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | 本发明公开一种基于基因改造益生菌表达外源药物的方法及其应用，利用同源重组和一步法无缝克隆敲除大肠杆菌Nissle1917必需基因dapA基因，获得大肠杆菌营养缺陷菌株Nissle1917ΔdapA，克隆dapA基因，构建营养缺陷株互补质粒pMalc2x‑dapA，将所述互补质粒pMalc2x‑dapA电击转化到所述Nissle1917ΔdapA菌株中，用同源重组替换pMalc2x载体上氨苄青霉素抗性基因ampR，获得无抗生素抗性标记的质粒平衡系统，体外合成sall4氨基端12个氨基酸多肽序列基因，并在N端融合胡萝卜软腐欧文氏菌果胶酶pelB信号肽基因序列，在C端加上His蛋白标签基因序列，一起克隆入互补质粒pMalc2x‑dapA，获得外源药物表达质粒pMalc2x‑dapA‑sall4，将该质粒导入大肠杆菌营养缺陷菌株Nissle1917ΔdapA，获得的菌株能有效表达sall4多肽，在肝癌治疗上有显著效果。 | ||
| 搜索关键词： | 质粒 菌株 大肠杆菌 营养缺陷 外源 基因改造 同源重组 克隆 益生菌 氨苄青霉素抗性基因 胡萝卜软腐欧文氏菌 氨基酸多肽序列 抗生素抗性标记 信号肽基因序列 必需基因 表达质粒 蛋白标签 电击转化 肝癌治疗 基因序列 平衡系统 体外合成 有效表达 氨基端 果胶酶 多肽 构建 敲除 应用 替换 基因 融合 | ||
【主权项】：
1.一种基于基因改造益生菌表达外源药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建大肠杆菌营养缺陷菌株Nissle1917ΔdapA：利用同源重组和一步法无缝克隆敲除大肠杆菌Nissle1917的必需基因dapA基因，获得大肠杆菌营养缺陷菌株Nissle1917ΔdapA；(2)所述营养缺陷菌株互补质粒的构建及转化：克隆dapA基因，替换pMalc2x的ampR基因，形成营养缺陷株的互补质粒pMalc2x‑dapA；将所述互补质粒pMalc2x‑dapA电击转化到所述Nissle1917ΔdapA菌株，获得无抗生素抗性标记的质粒平衡系统；(3)在所述质粒平衡系统导入外源药物基因，转化入Nissle1917ΔdapA，构建可分泌表达外源基因的肿瘤靶向工程菌。
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