[发明专利]一种用于药用牡丹和油用牡丹种质鉴定的方法

摘要

本发明公开了一种用于药用牡丹和油用牡丹种质鉴定的方法，本发明结构科学合理，使用安全方便，本发明采用Illumina HiSeq4000高通量测序平台对5年生药用牡丹“凤丹”根皮转录组进行测序的数据中，对检测到SSR序列进行筛选和引物设计，通过多态性筛选，设计合成M13加尾引物在不同来源药用牡丹和油用牡丹种质样本中进行多态性验证，并对获得的具有多态性产物再次测序，分析其序列长度，开发出一对微卫星分子标记引物，可以较好地应用于鉴别药用牡丹和油用牡丹种质，为药用牡丹和油用牡丹种质来源区分提供了有效可靠的鉴定手段，为解决中药牡丹皮的种质来源鉴定提供了一种新的手段，有着良好的推广价值。

主权项

1.一种用于药用牡丹和油用牡丹种质鉴定的方法，其特征在于：所述鉴定方法如下：步骤一：选取药用牡丹和油用牡丹作为验证样本；步骤二：选择仪器与试药，NAS‑99分光光度计、BC‑subMIDI电泳槽、BG‑Power300C电泳电源、1‑14离心机、Verity PCR仪、凝胶成像仪、DHP‑9052恒温培养箱、摇床、3730xl基因分析仪、HiSeq2500，内切酶HaeIII(NEB R0108M)、Hi‑Di去离子甲酰胺、POP‑7胶、10×Buffer(4311320)、Platinum taq酶(Thermo，10966026)；步骤三：引物设计与多态性引物筛选，采用改良CTAB法提取样品DNA，凝胶电泳检测质量，对合成的44对不同引物进行扩增，步骤四：将步骤三所述的44对不同引物进行扩增，TP‑M13‑SSR扩增反应体系为10μL，降落扩增程序；步骤五：将步骤四所述的不同引物进行扩增，降落扩增程序后用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，挑选有目的条带的产物上3730xl基因分析仪检测后进行数据分析；步骤六：通过不同来源的随机两份验证样本进行再次扩增后进行测序，筛选后获得6对具有多态性引物；步骤七：将步骤六所述筛选后获得5对多态性引物TP‑M13‑SSR所检测的不同药用牡丹和油用牡丹栽培种质在不同SSR位点的多态性原始数据；步骤八：观察验证原始测序峰图可以看出，利用筛选的SSR引物对20份不同种质材料进行扩增后测序，获得不同位点的等位基因片段大小。