[发明专利]一种利用家蚕生产蜘蛛丝的方法

摘要

本发明公开了一种利用家蚕生产蜘蛛丝蛋白的方法，包括如下步骤：1)在家蚕的丝素重链基因FibH上选择TALENs的两个靶点；2)分别构建用于表达TALENs的质粒；3)体外转录TALENs mRNA；4)构建包含蜘蛛丝基因MaSp1的donor载体；5)将TALENs mRNA和donor载体混合，对家蚕进行显微注射，注射后的蚕卵进行催青直到孵化，饲养出生产蜘蛛丝蛋白的家蚕个体。实验表明饲养孵化出来的G1代蚕卵中蜘蛛丝MaSp1基因替换了家蚕FibH基因，饲养的家蚕个体分泌出了蜘蛛丝，突破了传统转基因家蚕不能在家蚕丝腺中大量合成蜘蛛丝蛋白的限制。

主权项

1.一种利用家蚕生产蜘蛛丝蛋白的方法，包括如下步骤：/n1)在家蚕的丝素重链基因FibH上选择TALENs的两个靶点，第一靶点位于FibH基因的二号外显子上，第一靶点包括左半位点FibH1-L即TALEN左臂和右半位点FibH1-R即TALEN右臂，其中FibH1-L与FibH1-R之间有12-20bp的第一间隔序列作为切割序列；第二靶点位于FibH基因的3’非翻译区之外，第二靶点包括左半位点FibH2-L即TALEN左臂和右半位点FibH2-R即TALEN右臂，其中FibH2-L与FibH2-R之间有12-20bp的第二间隔序列作为切割序列；/n2)分别构建用于表达类转录激活因子效应物核酸酶TALEN1-L、TALEN1-R、TALEN2-L和TALEN2-R的质粒，其中TALEN1-L、TALEN1-R、TALEN2-L和TALEN2-R分别用于切割FibH1-L、FibH1-R、FibH2-L和FibH2-R；/n3)体外转录用于表达TALEN1-L、TALEN1-R、TALEN2-L和TALEN2-R的质粒，合成得到作为TALEN1-L、TALEN1-R、TALEN2-L和TALEN2-R翻译模板的TALENs mRNA；/n4)构建包含蜘蛛丝基因MaSp1的donor载体，该donor载体的两端分别含有第一靶点两旁的同源序列和第二靶点两旁的同源序列，两端同源序列之间含有用于替换基因FibH的目的基因MaSp1；/n5)将步骤3)中得到的mRNA和步骤4)中得到的donor载体混合，两者的终浓度各自控制在200-300ng/μl，对家蚕进行显微注射，注射后的蚕卵进行催青直到孵化，饲养孵化出来的蚁蚕，将当代G0的蚕蛾自交，获得G1代蚕卵，饲养出生产蜘蛛丝蛋白的家蚕个体。/n