[发明专利]一种腺病毒载体及其构建方法

摘要

本发明公开了提供了一种重组腺病毒载体及其构建方法。该方法为将pRed/ET(Δα)电转到含有pAV.Des1d载体的DB3.1感受态中，用一个包含同源臂的Kan抗性片段进行同源重组，通过连续抗性压力下筛选出只具有Amp+Kan抗性，而没有Amp+Cm抗性的阳性克隆。第二步重组用带同源臂的attR4‑Cm‑ccdB‑attR2或attR4‑Cm‑ccdB‑attR3进行重组，再利用抗性筛选出只具有Amp+Cm抗性，而没有Amp+Kan抗性的正确的阳性克隆，从而得到本发明腺病毒载体。本发明腺病毒表达载体，且具有很好的准确性、高效性，成功率高。大大降低了人力时间成本，提高了用户体验。

主权项

1.一种腺病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将pRed/ET载体中的Redα基因删除，得pRed/ET(Δα)载体；2)将pRed/ET(Δα)载体转入含pAV.Des1d质粒的DB3.1感受态细胞，复苏培养；3)将复苏培养后的产物涂布到同时含有氨苄抗生素Amp、氯霉素Cm和四环素Tc的培养基平板上，避光培养，挑取阳性克隆菌A；4)将上步所得阳性克隆菌A加入含L‑阿拉伯糖的培养基中诱导表达同源重组酶并制备成感受态细胞，将带同源臂的Kan抗性表达盒PCR产物转入其中进行重组反应，复苏培养；5)将步骤4)的复苏培养产物涂布到含Amp、Kan和Tc的培养基平板上，避光培养，挑取重组阳性克隆菌B；6)将步骤5)中得到的阳性克隆菌B分别在液体培养基扩大培养，其中在含Amp、Kan和Tc的抗性培养基中生长，且在含Cm抗性培养基中不能生长的克隆菌即为目的阳性克隆菌C；7)将步骤6)中得到的目的阳性克隆菌C加入L‑阿拉伯糖诱导表达同源重组酶并制备成感受态细胞，将带同源臂的attR4‑Cm‑ccdB‑attR2或带同源臂的attR4‑Cm‑ccdB‑attR3片断转入其中进行重组反应；复苏培养；8)将步骤7)中复苏培养产物涂布到含Amp、Cm和Tc的培养基平板上，36.5～37.5℃培养，挑取重组阳性克隆菌D；9)将步骤8)中得到的阳性克隆菌D分别在液体培养基扩大培养，其中在含Amp和Cm的抗性培养基中生长，且在含Kan和Tc抗性培养基中不能生长的克隆菌即为目的阳性克隆菌E；该步骤中所有培养的培养温度为36.5～37.5℃；提取阳性克隆菌E中的质粒即得腺病毒载体。