[发明专利]一种检测胃癌肿瘤标志物夹心型免疫传感器的制备方法及应用

摘要

本发明涉及一种检测胃癌肿瘤标志物夹心型免疫传感器的制备方法及应用，属于新型纳米功能材料、免疫分析和生物传感器领域。其制备三维多孔二硫化钼负载金纳米粒子h‑MoS₂/Au NPs作为基底材料修饰裸玻碳电极，提高肿瘤标志物捕获抗体的固载量，并有效加速电极表面的电子传递速率；制备正八面体氧化亚铜/二氧化钛核壳结构负载介孔铂铜纳米粒子Cu₂O@TiO₂/PtCu复合纳米材料固载检测抗体，并利用其对双氧水H₂O₂的优异电化学催化性能制得了简单、快速、灵敏的夹心型电化学免疫传感器，用于胃癌相关肿瘤标志物的检测。

主权项

1.一种检测胃癌肿瘤标志物夹心型免疫传感器的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：/n(1) 制备h-MoS₂/Au NPs/n取20~24 mg的(NH₄)₂MoS₄和2 mL、质量分数为1% 的HAuCl₄·4H₂O混合溶解在20 mL的超纯水中，超声10 min；随后，加入100 µL的水合肼溶液，超声30 min，使混合液均匀分散；将混合液转移到50 mL的聚四氟乙烯反应釜中，加热至180~220 ℃，反应8~12 h；冷却至室温，超纯水和乙醇依次离心洗涤2~4次；产物再次溶解在3 mL超纯水中，冻干机干燥，制得h-MoS₂/Au NPs；/n(2) 制备Cu₂O@TiO₂/PtCu-Ab₂检测抗体孵化物溶液/n将8~12 mL、2.0 mol/L的NaOH溶液逐滴加入到含3.33 g聚乙烯吡咯烷酮的100 mL、0.01 mol/L的CuCl₂溶液中，充分搅拌0.5 h；继续将8~12 mL、0.6 mol/L的抗坏血酸溶液逐滴加入到上述混合液中，55 ℃下充分搅拌2~4 h；离心分离，所得沉淀用超纯水和无水乙醇依次洗涤三次；室温下真空干燥12 h，制得Cu₂O正八面体；/n取23~27 mg的Cu₂O正八面体溶解于65 mL的超纯水中，超声10 min，分散均匀；将0.9~1.1 mL、0.02 mol/L的TiF₄水溶液缓慢逐滴加入到Cu₂O悬浮液中，充分搅拌1 h，使混合液均匀分散；将混合液转移到100 mL的聚四氟乙烯反应釜中，加热至160~200 ℃，反应0.5 h；冷却至室温，超纯水和乙醇依次离心洗涤2~4次；60 ℃真空干燥，制得Cu₂O@TiO₂正八面体纳米晶体；/n将80~120 mg的Cu₂O@TiO₂加入到8~12 mL的无水乙醇中，加入0.1~0.2 mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，70 ℃回流1.5~2.5 h，离心分离，超纯水洗涤，80 ℃干燥12 h，得到Cu₂O@TiO₂-NH₂；/n取0.3~0.5 g精氨酸和1.0~1.2 g聚乙烯吡咯烷酮溶解在45 mL的超纯水中，超声10min，分散均匀；磁力搅拌下，将3.5~4.0 mL、0.05 mol/L的H₂PtCl₆·4H₂O和1.0~1.5 mL、0.05 mol/L的CuCl₂溶液混合加入到上述混合溶液中，超声20 min，使混合液均匀分散；将混合液转移到聚四氟乙烯反应釜中，加热至180~220 ℃，反应1.5~2.5 h；冷却至室温，得到介孔PtCu合金纳米粒子溶液；/n将8~12 mg 的Cu₂O@TiO₂-NH₂加入到30 mL的介孔PtCu合金纳米粒子溶液中，振荡12 h，离心洗涤，制得Cu₂O@TiO₂/PtCu；配置3 mL、2.5 ~ 3.5 mg/mL的Cu₂O@TiO₂/PtCu检测抗体标记物溶液，加入3 mL、100 µg/mL的肿瘤标志物检测抗体Ab₂溶液，4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h；离心分离后，加入3 mL、pH=7.17磷酸盐缓冲溶液，得到Cu₂O@TiO₂/PtCu-Ab₂检测抗体孵化物溶液，4℃下保存备用；/n(3) 制备夹心型电化学免疫传感器/n1) 将直径为4 mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉打磨，超纯水清洗干净；/n2) 将6 µL、1.0~3.0 mg/mL的h-MoS₂/Au NPs溶液滴涂在电极表面，晾干，用超纯水冲洗，晾干；/n3) 继续将6 µL、8~12 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab₁溶液滴涂到电极表面，4℃晾干；/n4) 继续滴加3 µL、质量分数为0.1~1.0 %的牛血清白蛋白BSA溶液到修饰电极表面，以封闭电极表面上未结合Ab₁的非特异性活性位点，用pH为7.17的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4 ℃晾干；/n5) 超纯水冲洗掉未结合的BSA后，继续滴加6 µL、10 fg/mL~200 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原标准溶液到电极表面，4 ℃晾干，超纯水冲洗；/n6) 将6 µL、2.0~4.0 mg/mL的肿瘤标志物检测抗体孵化物Cu₂O@TiO₂/PtCu-Ab₂溶液滴涂到电极表面，室温下孵化30~60 min，用pH为7.17的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4 ℃晾干，制得一种检测胃癌肿瘤标志物的夹心型免疫传感器。/n