[发明专利]一种利用重组大肠杆菌连续发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法

摘要

本发明公开了一种利用重组大肠杆菌连续发酵制备5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸的方法，本发明的技术方案如下：以重组大肠杆菌作为出发菌株发酵制备5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸，在发酵过程中，需要进行连续补料，与此同时，生成的产物5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸通过0.45μm滤膜移出发酵罐，而大肠杆菌被滤膜截留在发酵罐中继续进行发酵制备产物，发酵结束之后，发酵液先后通过超滤浓缩、阳离子交换树脂进行分离纯化，随后利用有机溶剂萃取可获得总收率在90％以上，纯度在99.5％以上的5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸白色固体。该方法工艺简单，无需使用有毒溶剂或诱导剂，成本低廉，产品纯度高、产量高，适合工业化生产。

主权项

1.一种利用重组大肠杆菌连续发酵制备5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)种子液制备：种子液制备用培养基包括以下组分(以质量浓度计)：葡萄糖5‑20g/L、硫酸铵1‑10g/L、磷酸二氢钾2‑30g/L、硫酸镁0.1‑5g/L和水，所述水为溶剂，所述种子液制备用培养基的pH为6.0‑7.0，将大肠杆菌接种到所述种子液制备用培养基中，培养方法为：温度为20‑37℃、搅拌转速为50‑250rpm；(2)上罐发酵制备5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸：发酵用培养基包括以下组分(以质量浓度计)：葡萄糖10‑30g/L、硫酸铵3‑30g/L、磷酸二氢钾1‑20g/L、硫酸镁0.1‑5g/L、硫酸锌0.5‑5g/L、硫酸铜0.01‑0.5g/L、硫酸锰0.5‑5g/L、氯化钴0.1‑2g/L、亚硒酸钠0.01‑1g/L、维生素B10.005‑0.5g/L、维生素B20.005‑0.1g/L、维生素B60.005‑0.3g/L和水，所述水为溶剂，所述发酵用培养基的pH为6.0‑7.0，将步骤(1)所制得的种子液接种到发酵用培养基中，接种量为1‑4％，发酵罐装液量为发酵罐容积的60‑75％，培养方法为：温度为25‑37℃，搅拌转速为180‑600rpm，发酵开始1‑3h后进行连续补料，补料速度为10ml/min，直至发酵结束，所述补料溶液总量为培养基总体积的10‑30％，补料4‑6h后，发酵液通过0.45μm滤膜连续移出发酵罐，移出速度为5ml/min，直至发酵结束，此过程持续6‑12h，此过程结束后，发酵罐中剩余的发酵液通过离心机去除菌体，所述离心机的转速为3000‑9000rpm，随后合并上述过程中所有的发酵液，利用高效液相色谱法检测所述发酵液中5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸的浓度为10‑42g/L；(3)超滤浓缩：将步骤(2)合并后的发酵液进行超滤浓缩，所选用的超滤膜分子量大小为1000‑5000Da，收集超滤膜透过液，超滤浓缩的收率为98‑100％；(4)阳离子交换树脂分离纯化：采用阳离子交换树脂从步骤(3)中得到的超滤液中分离出含有5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸的料液，所述料液吸附速率为0.05‑0.5wt％/min、吸附温度为20‑40℃，等料液吸附完毕后，用纯水洗去未吸附物，然后用50％的浓硫酸或浓盐酸将料液从阳离子交换树脂中洗脱下来，料液洗脱速率为0.05‑0.5wt％/min、洗脱温度为20‑40℃，本步骤的收率为98‑99％；(5)萃取、浓缩和固体烘干过程：用萃取剂萃取步骤(4)所得的洗脱液中的5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸，萃取方法为：萃取温度为20‑30℃，萃取次数为2‑5次，萃取剂的用量为洗脱液质量的0.5‑3倍，萃取结束后，将含有5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸的萃取剂在77℃下进行蒸馏，除去萃取剂，析出的固体放入鼓风干燥箱中烘干即得5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸固体，利用高效液相色谱法检测所述5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸固体的纯度为99.5‑100％，整个制备过程的总收率为90‑96％。