[发明专利]一种高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法

摘要

本发明公开了一种高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法，包括以下步骤：A、挑选颗粒饱满完整、色泽鲜艳有光泽的木贼，消毒后接种于木贼愈伤组织诱导培养基，诱导出木贼愈伤组织；B、制备高产阿魏酸木贼干细胞培养液；C、选取步骤A所得的木贼愈伤组织作为种子，装入高产阿魏酸木贼干细胞培养液中悬浮培养，得木贼干细胞固体粉末；D、将步骤C获得的木贼干细胞固体粉进行破壁处理；E、将步骤D获得的细胞破壁匀浆混合物和无水乙醇按质量比1:（2‑3）混合，过滤，冷冻结晶，分离出柱型结晶，得高含量阿魏酸木贼提取物。本发明具有所得阿魏酸木贼提取物得率高，阿魏酸木贼提取物中阿魏酸含量高的优点。

主权项

1.一种高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：A、挑选新鲜木贼，先流水冲洗1‑3遍去除杂质、灰尘后，晾干表面水分，经过体积分数60‑80%的乙醇消毒30‑35s，然后用0.1%HgCl2 溶液消毒5‑10min，再用无菌水冲洗5‑8次，放在无菌滤纸上晾干；在无菌条件下用剪刀将木贼切成2‑5mm小段，接种于木贼愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，得到初级培养木贼愈伤组织；将得到的初级培养木贼愈伤组织再转接至木贼愈伤组织诱导培养基进行继代培养两次，得到增殖后的木贼愈伤组织；B、制备高产阿魏酸木贼干细胞培养液：按质量比称取45‑70% MS培养基、10‑25%卡拉胶、2.5‑5.5% 2,4‑二氯苯氧乙酸、1.5‑4.2%蔗糖、0.05‑0.2% 3‑吲哚丁酸、0.05‑0.35% N6‑异戊烯基腺嘌呤、0.04‑0.1%二氢茉莉酮酸甲酯，在玻璃容器中混合加热至75‑82℃，搅拌到完全溶解后冷却到室温，加入适量PBS缓冲液，调节溶液的PH至6.2‑6.7；C、选取步骤A所得的木贼愈伤组织作为种子，按接种量为质量比5%的比例,装入含250mL高产阿魏酸木贼干细胞培养液的500mL培养瓶中悬浮培养，摇床转速控制在100‑120rpm，培养温度控制在25±1℃，光照控制在1000‑1500lx，每天光照8小时，培养10‑12天得到乳白色团簇即木贼干细胞，收获乳白色团簇，用去离子水冲洗干净并冷冻干燥得木贼干细胞固体粉末；D、 按质量比1:（1‑3）将步骤C获得的木贼干细胞固体粉末与丙二醇混合搅拌均匀，使用高压均质机在25000PSI条件下进行破壁匀浆处理；E、 将步骤D获得的细胞破壁匀浆混合物和无水乙醇按质量比1:（2‑3）混合，依次通过10微米聚丙烯过滤器、医用活性炭过滤器、0.45微米聚丙烯过滤膜进行过滤，获得清液在‑10℃冰箱中静置24小时，下层得无色透明柱型结晶，用分液漏斗分出下层柱型结晶，用无水酒精淋洗干净后真空干燥，得高含量阿魏酸木贼提取物。