[发明专利]一种利用CRISPR/Cas9系统对紫花苜蓿基因定点突变的方法有效
| 申请号： | 201810724589.8 | 申请日： | 2018-07-04 |
| 公开（公告）号： | CN108866093B | 公开（公告）日： | 2021-07-09 |
| 发明（设计）人： | 陈海涛;王文;谢雄平;邱强;尚占环;苏克先;何辉 | 申请（专利权）人： | 广东三杰牧草生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/84 | 分类号： | C12N15/84;C12N15/113;C12N9/22;A01H5/00;A01H6/54 |
| 代理公司： | 北京化育知识产权代理有限公司 11833 | 代理人： | 尹均利 |
| 地址： | 510623 广东省广州市天河区兴民*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种利用CRISPR/Cas9系统对紫花苜蓿基因定点突变的方法。本发明首次在异花授粉的同源四倍体植物紫花苜蓿中使用CRISPR/Cas9技术，并获得突变植株；首次使用MtU6启动子在紫花苜蓿中启动sgRNA转录，提高转录效率；与自然突变以及传统人工诱导突变相比，本发明以更高的突变效率精准地引入突变，能达到突变率52%，其中纯合突变率达12%。本发明直接在基因编码序列上进行突变，为在紫花苜蓿中进行基因编辑开辟了新的领域，为后续同时沉默多个基因、染色体大片段缺失、外源基因精准插入靶点、基因调控等奠定了技术基础。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 利用 crispr cas9 系统 紫花苜蓿 基因 定点 突变 方法 | ||
【主权项】：
1.一种利用CRISPR/Cas9系统对紫花苜蓿基因定点突变的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤(1)构建紫花苜蓿中通用的由根癌农杆菌介导转化的双元表达载体MsCRISPR/Cas9；步骤(2)针对紫花苜蓿中的目标基因设计基于CRISPR/Cas9的靶标序列，将含有编码所述靶标序列的DNA片段连接到紫花苜蓿中通用的载体MsCRISPR/Cas9中构建载体MsCRISPR/Cas9::target；步骤(3)使用根癌农杆菌介导转化紫花苜蓿，实现对紫花苜蓿中特定基因的定点突变。
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