[发明专利]半滑舌鳎来源的外泌体夹心ELISA检测方法及试剂盒

摘要

一种半滑舌鳎来源的外泌体夹心ELISA检测方法及试剂盒，本发明属于鱼类生物技术领域，特别是海水鱼精液外泌体标志物应用领域。本发明利用抗CD63抗体作为捕获抗体、抗HSP90抗体作为检测抗体(酶标记抗体)，开发了针对半滑舌鳎精液来源的外泌体检测的双抗体夹心ELISA方法，并提供了一种可供鉴定及定量的试剂盒，用以鉴定半滑舌鳎精液中外泌体的标志蛋白，对于鱼类的其他体液来源的样本外泌体，以及其他标志蛋白鉴定具有重要的借鉴意义。本发明的方法特异性强，效率高且操作简单方便，且无需大型仪器设备及昂贵的化学试剂，具有推广价值。

主权项

1.一种半滑舌鳎来源的外泌体夹心ELISA检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：(1)样品收集：半滑舌鳎收集精液样本，收集精液后分别混样，进行精浆外泌体分离；(2)对外泌体提取后进行蛋白定量，然后分装保存于‑80℃备用；(3)包被：按照100μL/孔将抗CD63的抗体1加入酶标板孔中，孵育一定时间后移除悬液；(4)封闭：按照300μL/孔将封闭液加入酶标板孔中，孵育一定时间后移除封闭液并拍干；(5)检测：向每孔中加入100μL外泌体悬液，再加入50μL辣根过氧化物酶标记的抗HSP90抗体，混匀后孵育一定时间，移除并拍干，随后洗涤三次，拍干，再加入100μL/孔底物进行显色反应；(6)终止：按照100μL/孔加入酸性终止液，终止反应；(7)读数：采用双波长法以酶标仪进行读数，得到OD值；(8)判定结果：P/N值≥2.1则判定为阳性；对OD值及浓度作图，得到标准曲线。