[发明专利]一种转化菰cDNA文库改良水稻品种的方法

摘要

本发明公开了一种转化菰cDNA文库改良水稻品种的方法，涉及分子生物学领域。本发明通过构建菰的cDNA文库，并通过农杆菌介导转化进入水稻基因组中，高通量改良水稻品种，在获得的转基因系中筛选具有优良基因特性的个体，转基因系与野生型相比，在株高，分蘖、抽穗期、叶形、叶色方面均呈现出明显的变化，考种分析显示23个水稻转基因系与产量提升相关。本发明具有时间短、效率高、水稻突变性状丰富。对出现变化的水稻植株进行转基因验证分析，遗传背景明确，筛选可利用的优良基因用于后续水稻靶向改良。

主权项

1.一种转化菰cDNA文库改良水稻品种的方法，其特征在于，包含以下操作步骤：(1)菰cDNA文库的构建；(2)E.coli菰cDNA文库大规模质粒抽提；(3)菰目的cDNA过表达文库质粒电转化农杆菌，方法如下：(A)首先从‑70℃取出农杆菌感受态放置于冰上融解；(B)电转前加入2μL质粒DNA于100μL感受态细胞中，用枪头轻轻吹打混匀；(C)将质粒和细胞的LB混合物从一侧加入冰上预冷的电转杯，用吸水纸擦干净电转杯外面的水份，然后放在电转仪上以2500V高压进行电击；(D)迅速取出电转杯，加入900μL预冷的无抗生素LB培养液，轻轻吹打混匀，并吸出菌液转移到2mL离心管中，27℃，250rpm振荡培养2h，依次对农杆菌感受态进行电转，随后同样的条件进行摇菌；(E)涂平板时，每管各取100μL菌液涂在含氨苄青霉素的LB平板上，28℃倒置培养2‑3d，然后对平板上的菌落进行计数；(4)农杆菌介导菰cDNA转化改良水稻品种：(a)选择颖壳干净明亮的、当年的种子，剥去颖壳，在无菌操作台上将其置入100mL灭菌的锥形瓶中，用灭菌的蒸馏水清洗种子3次，再用75％酒精消毒2次，每次1min，然后用灭菌的蒸馏水洗3次除去酒精以后，用0.15％的升汞消毒15min，期间用手摇动锥形瓶，弃去升汞，用灭菌水清洗种子3次，然后将多余的水分除尽，按每平皿10粒种子将种子接种到N6固体培养基上，封口膜封好，28℃黑暗条件下，培养35天；(b)将黄色胚性愈伤组织接种到新的继代培养基上，28℃避光培养20d，挑选亮黄色、干燥的致密胚性愈伤接种到预培养培养基上，此培养基加有羧基乙酰丁香酮，28℃黑暗条件下培养3天；(c)将含有菰cDNA的农杆菌涂布于含有Rif和氨苄青霉素的LB固体培养基上，28℃黑暗培养28h，在无菌操作台上，用枪头吸取农杆菌悬浮培养基轻轻吹打含有菰cDNA的农杆菌，然后再吸取这些溶液加入到50mL农杆菌悬浮培养基中，同时加入50uL，50mg/mL的羧基乙酰丁香酮，标定OD600为0.1，然后加入在AS上生长3天的愈伤组织，42℃条件下热孵育30min；(d)在无菌操作台上尽量除尽菌液，将愈伤组织摊开置于已经灭菌的带有滤纸平皿上吹风1h，直到愈伤组织表面水分被吹干，随后，将其转移到共培养培养基上，22℃，黑暗下培养3d；(e)在无菌操作台上，将共培养后的愈伤组织放到大小为250mL三角瓶里，用2L灭菌的ddH2O洗5次，用含400mg/L头孢霉素的无菌双蒸水洗涤2次，每次持续时间15min，用手摇动，然后将愈伤组织摊开在带有无菌滤纸的平皿上进行表面干燥；(f)将上述表面干燥的愈伤组织接种到含有450mg/L头孢霉素60mg/L氨苄青霉素的筛选培养基上进行筛选，每平皿放置愈伤组织15颗，28℃黑暗条件下培养20天，再将愈伤组织接种到新的含有450mg/L头孢霉素、60mg/L氨苄青霉素筛选培养基上进行第二次筛选，28℃黑暗条件下培养20天；(g)将长出的黄色致密的愈伤组织进行分化，配制分化培养基放置4～6天，然后，将待分化的愈伤组织接种到培养基上，28℃光下生长15～20天，幼苗长至2～4cm，将其移至1/2MS生根培养基上生根；(h)当转基因苗根系足够发达，能够适应土壤生长环境时就可以对其进行炼苗，将其放置于栽培环境中生长3天，然后加无菌ddH2O炼苗4d，将转基因苗从培养基中直接取出并栽培到土壤中；(i)转基因得到的水稻转基因系经过T0代、T1代和T2代的种植和表型观察，筛选优良水稻品系。