[发明专利]蟛蜞菊内酯在制备治疗肺癌产品中应用的研究方法

摘要

本发明属于生物科技领域，具体涉及一种蟛蜞菊内酯在制备治疗肺癌产品中应用的研究方法。本发明研究了蟛蜞菊内酯对非小细胞肺癌A549细胞活性、周期和凋亡的影响，以及对细胞p‑Caspase3、p53、p‑STAT1、STAT1基因表达的干预作用，探讨蟛蜞菊内酯对A549细胞的抗肿瘤作用及其机制，提供一种蟛蜞菊内酯在制备治疗肺癌产品中应用的研究方法，为今后中药治疗非小细胞肺癌的机制研究提供理论基础。本发明包括细胞培养的步骤、用CCK‑8法检测细胞增殖抑制率的步骤、用碘化丙啶及Annexin‑PI染色检测细胞周期及凋亡的步骤以及用RT‑PCR及Western blot检测细胞基因转录及翻译的步骤。

主权项

1.蟛蜞菊内酯在制备治疗肺癌产品中应用的研究方法，其特征在于，包括以下步骤：细胞培养的步骤：复苏A549细胞后，每2～4天继代培养一次；CCK‑8法检测细胞增殖抑制率的步骤：在孔板上接种生长期细胞，之后分别用10、20、30μmol/L蟛蜞菊内酯作用细胞12、24、36h，每孔加CCK‑8孵育，之后采集各孔光密度值；碘化丙啶及Annexin‑PI染色检测细胞周期及凋亡的步骤：在孔板上接种生长期细胞后分为对照组和蟛蜞菊内酯组，对照组每孔添加新鲜培养液，蟛蜞菊内酯组每孔加含蟛蜞菊内酯的新鲜培养液，之后收集细胞，一部分样本乙醇固定过夜，RNase A水浴，PI孵育，流式检测周期；剩余样本结合缓冲液重悬，取悬液于流式管中，Annexin V‑FITC和PI孵育后，流式检测凋亡；RT‑PCR及Western blot检测细胞基因转录及翻译的步骤：细胞接种、培养、分对照组和蟛蜞菊内酯组，对照组每孔添加新鲜培养液，蟛蜞菊内酯组每孔加含蟛蜞菊内酯的新鲜培养液，之后收集细胞，一部分样本提总RNA并反转录，cDNA扩增，95℃预变性3min，95℃变性7s，56℃退火延伸30s，45个循环，凝胶成像；剩余样本RIPA提取总蛋白，SDS‑PAGE后，以p‑Caspase3、p53、p‑STAT1、STAT1、GAPDH为一抗，孵育过夜，室温孵育二抗，化学发光仪曝光条带。