[发明专利]一种筛选鉴定拮抗黄曲霉菌的菌株的方法

摘要

本发明公开了一种筛选鉴定拮抗黄曲霉菌的菌株的方法，包括黄曲霉孢子悬液的配制、拮抗菌的初筛、拮抗菌的复筛得到拮抗菌；通过形态学特征、生理生化特征、16SrDNA及gyrB基因序列分析对其进行鉴，筛选出一种对黄曲霉菌有明显抑制的菌株B10，经鉴定确认B10菌株为解淀粉芽孢杆菌。为防控黄曲霉毒素B₁真菌毒素中毒提供新的方法和理论依据，该发明具有重要的生产实践意义。

主权项

1.一种筛选鉴定拮抗黄曲霉菌的菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)黄曲霉孢子悬液的配制将黄曲霉产毒菌株接种到高盐查氏斜面试管培养基上，于恒温培养基37℃培养72‑96h，等待其孢子充分形成，加入4mL灭菌水，将试管内的黄曲霉孢子刮下，倒入装有灭菌水的三角瓶，并放入摇床振荡使孢子分散，将分散的孢子液用纱布过滤，制成黄曲霉孢子悬液，用血球计数板计数，把黄曲霉孢子悬液浓度调至107cfu/mL；(2)拮抗菌的初筛将配好的黄曲霉孢子悬液迅速倒入冷却至45℃左右还未凝固装有的PDA培养基的三角瓶之中，摇匀使黄曲霉孢子悬液与PDA培养基混匀，再迅速将其倒入灭菌的平皿中，待其凝固，用接种环挑取待试菌落在制好的平板上用十字划线法划十字，并做一空白对照组，在恒温培养箱28℃下培养，72h后观察结果，选出具有拮抗作用的初筛的菌株；(3)拮抗菌的复筛将初筛的待试菌落在GAM液体培养基增菌24h，将菌液采用离心机离心两遍再用0.22μm无菌滤器滤掉菌体，把无菌上清液装在新的离心管中，用倾注平板法把1mL的无菌上清液迅速倒入未凝固的PDA培养基平板中，混匀，等其凝固用灭菌的2mm打孔器在平板中间打孔，将配好的黄曲霉孢子悬液用移液管向孔内注入25μL，以无菌空白培养基代替上清液做对照于恒温箱28℃培养72h左右，观察结果，选出有明显拮抗效果的菌株；(4)拮抗菌的鉴定常规鉴定：接种新鲜的菌株于LB平板上培养24h，观察菌落形态特征，若菌株菌落单一、形态正常，则立即取样进行革兰氏染色，并且于高倍显微镜下观察菌体形态；生化鉴定：测定芽孢菌中常见的细菌生理生化指标；分子鉴定：采用通用引物27F：5’‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3’和1492R：5’‑GGCTACCTTGTTACGACTT‑3’进行菌株16S rDNA的PCR扩增，由上海生工生物公司合成的引物UP‑1S：5’‑ATTGGTGACACCGATCAAACA3‑’和UP‑2SR：5’‑TCATACGTATGGATGTTATTC3‑’3进行菌株gyrB基因的PCR扩增；PCR反应体系以黄曲霉拮抗菌株基因组DNA作为PCR扩增的模板，终浓度为50μL，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，然后进行序列测定，再使用BLAST程序对16S rDNA和gyrB基因序列GenBank数据库中的gyrB基因进行比较，应用DNAstar以及mega7软件进行同源性分析以及发育树的建立。