[发明专利]单链寡核苷酸的制备方法

摘要

本发明涉及一种单链寡核苷酸的制备方法，首先进行PEAR反应，模板为N’‑X’‑R’‑N’‑X’，R’为能产生3’突出末端的耐高温限制性内切酶的识别位点，N’为切刻内切酶的识别位点，经过高温变性、退火、延伸，得到延伸产物双链N’‑X’‑R’‑N’‑X’/N‑X‑R‑N‑X；利用能产生3’突出末端的限制性内切酶对双链进行切割，得到片段(N‑X/N’‑X’)；没有被酶切的双链作为模板直接参与下一轮的扩增，而且模板在退火过程中通过滑动作用而继续延伸，串联重复序列增加，目的产物持续指数增长。然后进行切口引物延伸反应，切刻内切酶对PEAR酶切产物中的N‑X链进行切割，产生单链缺口，另外一条单链保持完整，随后聚合酶以缺口为起点进行延伸，切刻内切酶识别位点重新形成；同时通过置换下游的目的单链X，得到游离的单链。

主权项

1.一种单链寡核苷酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)设计模板N’‑X’‑R’‑N’‑X’，R’为能产生3’突出末端的耐高温限制性内切酶的识别位点，N’为切刻内切酶的识别位点，X’为目的单链X的互补序列；(2)PEAR反应：模板经过高温变性、退火、延伸，得到延伸产物双链N’‑X’‑R’‑N’‑X’/N‑X‑R‑N‑X；利用能产生3’突出末端的限制性内切酶对双链进行切割，得到较短的片段(N’‑X’/N‑X)，该片段单链带有3’端突出的粘性末端；由于酶切不完全，没有被酶切的双链作为模板直接参与下一轮的扩增，而且模板在退火过程中通过滑动作用而继续延伸，串联重复序列增加，周而复始，实现目的产物的持续指数增长；(3)切口引物延伸反应：对PEAR酶切产物进行纯化，切刻内切酶对PEAR酶切产物中的N‑X链进行切割，产生单链缺口，另外一条单链保持完整，随后聚合酶以缺口为起点进行延伸，切刻内切酶识别位点重新形成；同时通过置换下游的目的单链X，得到游离的单链。