[发明专利]基于棘球蚴微管蛋白为靶点的抗棘球蚴病高通量药物筛选方法有效
| 申请号： | 201810762418.4 | 申请日： | 2018-07-12 |
| 公开（公告）号： | CN110716035B | 公开（公告）日： | 2023-02-28 |
| 发明（设计）人： | 刘丛珊;姚嘉青;张皓冰;陶奕;薛剑;尹建海 | 申请（专利权）人： | 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 |
| 主分类号： | G01N33/50 | 分类号： | G01N33/50;C12N15/12;C12N15/70;C07K14/435;C07K1/22 |
| 代理公司： | 上海市汇业律师事务所 31325 | 代理人： | 王函 |
| 地址： | 200025 *** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种基于细粒棘球蚴和多房棘球蚴微管蛋白为靶点的抗棘球蚴高通量药物筛选方法，包括以下步骤：分别连接细粒棘球蚴和多房棘球蚴各14个α‑微管蛋白同型基因和11个β‑微管蛋白同型基因到质粒载体，得到包含质粒载体的蛋白表达基因工程菌；重组微管蛋白的表达及纯化；完成其体外聚合作用，将重组微管蛋白与待测药物进行共孵育，以药物对重组微管蛋白体外聚合的影响来筛选抗棘球蚴新药。本发明通过评价药物对微管蛋白聚合的促进或抑制作用，可以高效、简便、经济地高通量筛选基于微管蛋白的抗棘球蚴药物。本发明为抗棘球蚴病药物的筛选提供了新思路，可用于寻找有效的新药物或先导化合物，以治疗棘球蚴病。 | ||
| 搜索关键词： | 基于 棘球蚴 微管 蛋白 抗棘球蚴病高 通量 药物 筛选 方法 | ||
【主权项】：
1.一种基于棘球蚴微管蛋白为靶点的抗棘球蚴病高通量药物筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：/n（1）基因工程菌的构建和验证：以pET-28a（+）和pET-30a（+）等原核表达质粒为载体，在强启动子T7的下游分别连接细粒棘球蚴和多房棘球蚴各14个α-微管蛋白同型基因Eg/EmTUA1~ Eg/EmTUA14和11个β-微管蛋白同型基因Eg/EmTUB1~ Eg/EmTUB11，使重组表达的棘球蚴α-和β-微管蛋白的N端带上6个连续的组氨酸标签6×His，得到的蛋白表达基因工程菌的质粒载体分别为pET28a/pET30a-Eg/EmTUA1 ~ pET28a/pET30a-Eg/EmTUA14和pET28a/pET30a-Eg/EmTUB1 ~ pET-28a/pET30a-Eg/EmTUB11；/n（2）重组微管蛋白的表达及纯化：将所述的蛋白表达基因工程菌的质粒载体通过热激法转化至感受态大肠杆菌BL21（DE3）中，得到重组BL21（DE3）细胞在LB培养基进行培养并用IPTG诱导表达，获得主要以包涵体形式存在的重组微管蛋白；利用镍离子Ni2+金属螯合亲和层析柱上复性方法大量获得纯化的重组微管蛋白；/n（3）高通量药物筛选方法的构建：棘球蚴重组α-微管蛋白同型和β-微管蛋白同型在0.25mg/mL~4mg/mL的浓度范围发生聚合，其聚合过程用酶标仪检测其动力学特征；将能产生最佳聚合效果的相应浓度的重组微管蛋白与待测药物进行共孵育，并利用酶标仪进行检测，观察重组微管蛋白聚合效率的变化，以检测待测药物对重组微管蛋白体外聚合的影响，以此筛选以棘球蚴微管蛋白为靶点的治疗棘球蚴病药物。/n
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