[发明专利]一种制备可实时检测间充质干细胞骨分化的细胞模型的方法

摘要

本公开提供了一种制备可实时检测间充质干细胞骨分化的细胞模型的方法，该方法包括如下步骤：S1、将针对骨分化相关基因的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；S2、形成待转染AAV病毒颗粒；S3、将干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；S4、向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行转染，得到转染后的培养物；S5、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，通过PCR及测序并筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株。通过上述技术方案，本发明可以实现在干细胞药物制备过程中，实时监测连续传代的细胞的成骨分化状态。

主权项

1.一种制备可实时检测间充质干细胞骨分化能力的细胞模型的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：S1、将针对骨分化相关基因的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；所述骨分化相关基因为SPP1或COL1A1；所述骨分化相关基因的敲入位点为所述骨分化相关基因的最末一个有义密码子和终止密码子之间；S2、将插入有模板DNA同源重组载体包装到AAV病毒中，形成待转染AAV病毒颗粒；所述模板DNA包括针对所述骨分化相关基因的敲入位点的左同源臂序列和右同源臂序列，所述左同源臂序列和所述右同源臂序列之间插入有自剪切2A肽编码序列和荧光蛋白报告基因，以使得定向敲入后形成编码由骨分化相关基因、2A肽和荧光蛋白串联而成的融合蛋白的融合基因；所述sgRNA如SEQ ID NO. 1所示，所述左同源臂序列如SEQ ID NO. 2所示，所述右同源臂序列如SEQ ID NO. 3所示；或者，所述sgRNA如SEQ ID NO. 4所示，所述左同源臂序列如SEQ ID NO. 5所示，所述右同源臂序列如SEQ ID NO. 6所示；S3、将间充质干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；S4、在电转结束后1‑30分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行4‑30小时的转染，得到转染后的培养物；S5、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，并通过PCR及测序筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株。