[发明专利]抵抗细胞衰老及延长血糖调节作用时程的间充质干细胞及其制备方法和用途

摘要

本公开提供了一种制备抵抗细胞衰老及延长血糖调节作用时程的间充质干细胞的方法，该方法包括如下步骤：S1、将针对基因插入安全岛的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；S2、形成携带GPX7基因的待转染AAV病毒颗粒；S3、将干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并进行电转；S4、加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行的转染；S5、进行单克隆化培养并筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株；S6、扩增并定向诱导分化成为MSC。本公开还提供了上述方法制备得到的间充质干细胞及其用途。通过上述技术方案，本发明获得了一种抵抗细胞衰老及延长血糖调节作用时程的多能干细胞制备方案。

主权项

1.一种制备抵抗细胞衰老及延长血糖调节作用时程的间充质干细胞的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：S1、将针对基因插入安全岛的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；S2、将插入有模板DNA的同源重组载体包装到AAV病毒中，形成待转染AAV病毒颗粒；所述模板DNA包括针对基因插入安全岛的敲入位点的左同源臂序列和右同源臂序列，所述左同源臂序列和所述右同源臂序列之间插入有GPx7基因；所述左同源臂序列和所述右同源臂序列之间插入的序列如SEQ ID NO. 4所示；所述sgRNA如SEQ ID NO. 1所示；相应地，所述左同源臂序列如SEQ ID NO. 2所示；相应地，所述右同源臂序列如SEQ ID NO. 3所示；S3、将iPSC细胞或胚胎干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；S4、在电转结束后1‑30分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行4‑30小时的转染，得到转染后的培养物；S5、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，并通过PCR及测序筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株；S6、将所述进行了基因定向敲入的单克隆细胞株扩增并定向诱导分化成为间充质干细胞。