[发明专利]人胎盘绒毛膜组织的制备冻存方法和应用

摘要

本发明公开了一种人胎盘绒毛膜组织的制备冻存方法，包括：(1)胎盘羊膜、蜕膜的分离及冻存；(2)胎盘绒毛膜下大血管组织的分离及冻存；(3)胎盘绒毛膜组织的分离及冻存；(4)胎盘绒毛组织的处理及冻存。本发明还给出了冷冻保存后复苏的方法。本发明的冷冻保存方法有利于提高冻存组织和细胞的活性，复苏后形态、功能、结构与新鲜组织一致，组织内细胞总体存活率达90％以上，所保存的组织不但可以用于分离干细胞，上皮细胞等领域，还可以用于组织工程移植等领域。

主权项

1.一种人胎盘绒毛膜组织的制备冻存方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)将胎盘洗净；沿胎盘边缘剪下已脱落的蜕膜，除去羊膜；(2)将上述已去除羊膜的胎盘胎儿面绒毛膜及大血管一起分离，清洗，并冲洗血管以去除血管内滞留血块，将与绒毛膜板连接的大血管剪下；(3)胎盘绒毛膜组织的分离及冻存：将绒毛膜板纵向剪成条形片；将剪成的条形片放入冻存袋或冻存管，按下述方式加入冻存液：首先，4℃条件下，加入冻存液1，平衡5min；其次，0℃条件下，加入冻存液2，平衡15min；最后，加入冻存液3；三次加入的冻存液的体积比为3:1:1；然后，转入程序降温仪，按照设定的降温程序降温至‑80℃～‑90℃，转移至液氮冷冻保存；所述降温程序为：降温至4℃，保持2～5min；以1℃/min速率降低至0℃，保持5～10min；5～10min内降温至‑10℃，保持5～10min；40～60min内降温至‑40℃，然后在1～3min内降至‑80℃～‑90℃，保持5min；所述冻存液1，由MEM缓存溶液和二甲基亚砜组成，其中，二甲基亚砜占5～10wt％；所述冻存液2，由MEM缓存溶液、二甲基亚砜和右旋糖酐40组成，其中，二甲基亚砜占5～10wt％，右旋糖酐40占50～70wt％；所述冻存液3，由质量浓度为20％的人血白蛋白溶液、二甲基亚砜、丙二醇、羟乙基脲和海藻糖组成，其中，各组分所占比例为：二甲基亚砜5～10wt％，丙二醇5～10wt％，羟乙基脲5～10wt％，海藻糖5～10wt％，余量为人血白蛋白溶液。