[发明专利]一种重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法及其应用

摘要

本发明公开了一种重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法及其应用，所述制备方法包括以下步骤：A.进行目的基因的扩增：以提取肺炎链球菌R6基因组为模板，采用引物P1和P2进行基因扩增；B.重组克隆菌株的构建：将扩增得到的二氢叶酸还原酶基因回收后连接到pEASYTM‑T1 Simple克隆质粒上，得到重组克隆载体，将重组克隆载体转化到感受态细胞；C.重组表达菌株的构建：将双酶切后获得的重组二氢叶酸还原酶基因连接到进行相同酶切处理的表达载体pET‑28a上，将重组表达载体pET‑28a‑dhfr转化到大肠杆菌中，筛选得到重组表达菌株；D.重组二氢叶酸还原酶的表达。上述制备方法简单，制备的重组表达菌株性状稳定，培养和表达周期短，能稳定表达高活性的重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶。

主权项

1.一种重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：A.目的基因的扩增：提取肺炎链球菌R6基因组，以所述基因组为模板，采用引物P1和P2进行基因扩增，得到二氢叶酸还原酶基因，即目的基因，所述二氢叶酸还原酶基因的序列为SEQID NO:1所示的核苷酸序列，所述引物P1的序列为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，所述引物P2的序列为SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；B.重组克隆菌株的构建：将扩增得到的二氢叶酸还原酶基因回收后连接到pEASYTM‑T1 Simple克隆质粒上，得到重组克隆载体，将重组克隆载体转化到Trans1‑T1感受态细胞中，筛选阳性重组克隆菌株，并进行鉴定；C.重组表达菌株的构建：将阳性重组克隆菌株过夜培养后进行质粒提取，将提取到的重组克隆质粒进行NdeI和XhoI双酶切，得到二氢叶酸还原酶基因，将二氢叶酸还原酶基因连接到进行相同酶切处理的表达载体pET‑28a上，得到重组表达载体pET‑28a‑dhfr，将重组表达载体pET‑28a‑dhfr转化到大肠杆菌BL(DE3)中，筛选后得到高效表达重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的重组表达菌株；D.重组二氢叶酸还原酶的诱导表达：将重组表达菌株进行培养，并向培养液中添加IPTG，诱导重组表达菌株表达重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶。