[发明专利]一种基于银染增强的纳米金技术检测核酸的方法

摘要

本发明公开了一种基于银染增强的纳米金技术检测核酸的方法。首先通过设计指示探针RP和捕获探针CP分别与目标物DNA‑7a两端互补，磁珠标记捕获探针形成MB‑CP结构，金纳米标记识别探针形成Au‑RP结构。在目标物核酸的存在情况下，磁珠上修饰的捕获探针以及金纳米修饰的识别探针分别与目标物的两端完全互补，形成“三明治”复合物结构，利用金纳米良好的催化作用，用银染增强的方式实现信号的放大，经磁性分离，硝酸消解沉积在金纳米上面的银后，再通过差分脉冲溶出伏安法检测其信号，从而定量检测目标物。该方法选择性好、灵敏度高、仪器简单，在遗传疾病的临床诊断中有着重大的实际意义和应用价值。

主权项

1.一种基于银染增强的纳米金技术检测核酸的方法，其特征在于具体步骤为：（1）纳米金合成制备：移取100 mL质量百分比浓度为0.01%的氯金酸溶液倒入圆底烧瓶中，将其放置油浴锅中加热煮沸后迅速加入3 mL 质量百分比浓度为1%的柠檬酸钠溶液作为还原剂，继续加热15分钟，观察溶液的颜色从最初的淡黄色逐渐变成酒红色，最后停止加热冷却至室温，并且全程处于搅拌状态下进行；通过扫描电子显微镜表征可知纳米金的粒径为16nm；（2）金标记识别探针Au‑RP的制备：移取60 μL 浓度为10 μmol/L巯基修饰的DNA识别探针RP加入60 μL含10 mmol/L 三(2‑羧乙基)膦浓度为10 mmol/L pH 5.8的磷酸盐缓冲溶液中活化2小时，活化完毕后加入1 mL步骤（1）合成的浓度为5.8 nmol/mL金纳米溶液，立即震荡均匀并迅速裹上锡纸避光孵育16小时；接着分别往里加入11.3 μL质量百分比浓度为10% 的十二烷基硫酸钠溶液，使最终质量百分比浓度为0.1 %，加入125.7μL浓度为0.1mol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液，使其最终浓度为10 mmol/L，再加入66.16μL浓度为2 mol/L 的NaCl，使其最终浓度为0.1mol/L；在孵育24小时后使用高速离心机以10000 转/分钟离心20分钟，分散至含0.1 mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液中并重复清洗3次，去掉上清液，最后分散至含1 mL 含0.1 mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液中，震荡均匀，放置在4℃的黑暗环境中储存备用；（3）磁珠标记捕获探针MB‑CP的制备：量取1 mg磁珠置于离心管中，经过磁性分离，弃去上清，然后用100 μL TTL缓冲溶液清洗1次，该溶液中含100 mmol/L pH 8.0 Tris‑HCl、体积百分比浓度为0.1% Tween® 20、1mol/L LiCl ，接着分散至200 μL TTL缓冲溶液中，然后往溶液中加入50 μL浓度为10 μmol/L生物素修饰的DNA捕获探针CP，在室温下轻微震荡孵育15分钟，以使生物素修饰的探针与链霉亲和素包被的磁珠轻缓而充分地结合，最后使用100μL TT 缓冲溶液清洗2次，溶该液中含250 mmol/L pH 8.0 Tris‑HCl、体积百分比浓度为的0.1% Tween® 20 ，磁性分离，弃去上清液，分散至500 μL含0.2mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中储存备用；（4）探针杂交反应：移取10 μL步骤（3）中制备的浓度为10mg/mL的MB‑CP溶液、10 μL浓度范围为50 fmol/L~250 pmol/L的目标物和30 μL含0.1mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4磷酸盐缓冲溶液放进0.2 mL离心管，震荡混匀后置于PCR仪中30 ℃加热30 分钟，取出溶液进行磁性分离，用含0.1mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液清洗2次后，分散在50 μL含0.1mol/L NaCl 浓度为10 mmol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液溶液中，随后往溶液中加入10 μL步骤（2）中制备的浓度为5.8 nmol/mL的Au‑RP溶液，震荡混匀后置于PCR仪中在30 ℃下孵育45分钟，磁性分离，分别用100 μL含0.1mol/L NaCl 浓度为10 mmol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液、含0.1 mol/L NaNO3 10 mmol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液以及0.1 mol/L NaNO3进行清洗，去除游离的纳米金探针；（5）银染和电化学分析检测：银增强剂溶液通过混合三种溶液制备，首先制备浓度为15 mmol/L的 AgNO3，浓度为50 mmol/L的对苯二酚以及浓度为150 mmol/L的柠檬酸和50 mmol/L柠檬酸三钠，这三种溶液分别为溶液A、溶液B和溶液C，使用前的体积混合比例为1：1：1，溶液B和溶液C在银染之前的半个小时左右开始在水浴锅中保持30℃温育；在清洗后的产物中加入银染溶液并快速震荡混匀且放置在光线暗淡的环境中反应12 分钟，3分钟一次，反应完毕后立即加入50μL浓度为0.3mol/L的 Na2S2O3溶液终止反应，避免产生非特异性的沉淀；磁性分离去除上清液，加入去离子水清洗3~5次后加入100 μL 体积百分比浓度为50%的 HNO3消解30分钟；消解完毕后将溶液全部移至1.9 mL浓度为0.1 mol/L HNO3/KNO3溶液中，应用处理好的玻碳电极在 ‑0.5 V 搅拌富集5分钟，静置30 秒，利用时差脉冲溶出伏安法在 0 V ~ 0.7 V 范围内扫描，记录电化学响应；峰电流信号与不同目标物浓度成正相关，通过一系列实验条件优化，确定杂交时间60分钟，银染的时间12分钟，3分钟一次，沉积时间300秒，沉积电位‑0.5 V为最优实验条件，还原峰电流与目标物浓度的对数有着良好的线性关系,线性方程式为Y=1.2632X+11.6395，R=0.9911，检测范围为50fmol/L~250pmol/L，检出限为17fmol/L；（6）方法特异性：在最优的实验条件下，分别取10 µL相同浓度的错配序列DNA‑7a、DNA‑7b、DNA‑7c、DNA‑7d、DNA‑7e、DNA‑7g按照以上实验原理进行杂交、银染和检测。