[发明专利]一种检测稻曲病病菌的方法

摘要

本发明公开了一种检测稻曲病病菌的方法，涉及分子生物学领域。本发明通过RAPD引物转化SCAR标记，可快速鉴定稻曲病病原菌，特异性高，无须根据稻曲病病菌的基因组DNA序列设计筛选特异性引物，直接提取样本DNA序列后即可进行鉴定，有效提高稻曲病病菌的鉴定效率。

主权项

1.一种检测稻曲病病菌的方法，其特征在于，包含以下操作步骤：(1)将已知的稻曲病菌株活化培养后收集菌丝球，滤纸吸干菌丝外表水分，放入‑20℃冰箱储存备用；(2)菌丝冷冻干燥后采取CTAB法提取DNA，检测提取DNA的浓度和纯度，之后将检测的DNA样品放入‑20℃冰箱保存备用；(3)采用随机引物对供试菌株DNA进行PCR扩增，产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，80V电泳45min后切胶回收DNA；(4)将回收的稻曲病菌特异性随机引物扩增片段与pGEM‑T载体连接后转入大肠杆菌DH‑5α中；(5)采用菌落PCR筛选阳性单克隆，单克隆摇菌培养后提取质粒，对插入片段测序；(6)将测序后的序列输入NCBI核酸数据库作BLAST分析，与GeneBank中己有序列进行同源性对比，验证序列为稻曲病菌的特异性序列，采用Primer 5.0设计病菌分子检测的特异性SCAR引物；(7)在稻曲病发生的田块，于水稻黄熟期，采集病穗的谷粒，70％乙醇浸泡1min，无菌条件下分别剥取病穗谷粒颖壳和健穗谷粒颖壳各1g，CTAB法提取DNA，将提取的DNA测定浓度并稀释后作为DNA模板；(8)采用SCAR引物对待测稻曲病菌DNA进行扩增，产物进行1.6％琼脂糖凝胶电泳，恒压80V电泳45min，紫外下在400bp处出现条带即为稻曲病菌鉴定阳性。