[发明专利]一种抗流行性感冒病毒EGS核酸药物的合成

摘要

本发明公开了一种抗流行性感冒病毒EGS核酸药物的合成，它包括以下步骤：步骤一，RNase P在EGS引导下对流行性感冒病毒基因mRNA进行切割的靶序列区域的确定；步骤二，EGS的设计:EGS的结构通常由5’结合区序列、tRNA的T茎环与额外环区序列及3’结合区序列三个部分组成；步骤三，EGS的人工合成：将设计好的EGS序列进行合成，备用；步骤四，合成的结果：根据序列通式5'‑U/CGNNNNNNU‑3'，在流感病毒八个基因片段中搜寻到100个左右潜在切点。本发明对某些基团进行化学修饰以提高其稳定性和导入效率，极大地提高EGS基因药物的效率，强化抗流感的广谱性。

主权项

1.一种抗流行性感冒病毒EGS核酸药物的合成，其特征是它包括以下步骤：步骤一， RNase P在EGS引导下对流行性感冒病毒基因mRNA进行切割的靶序列区域的确定：确定靶RNA中潜在切点，靶RNA的高效切割位点具备以下特征，即切点的‑1和+1位应分别为嘧啶(U/C)和鸟嘌呤(G)，切点的+8位最好应为尿嘧啶(U)，因此，根据序列通式5’‑U/CGNNNNNNＵ‑3’在流行性感冒病毒PA、PB1、M1基因中搜寻潜在切点；步骤二，EGS的设计:EGS的结构通常由5’结合区序列、tRNA的T茎环与额外环区序列及3’结合区序列三个部分组成，其中，T茎环与额外环区序列是固定的，全部EGS的该部分序列均选自于人tRNA，5’结合区和3’结合区序列在不同EGS则不相同，在GeneBank中寻找A型流感病毒临床毒株靶序列PA, PB1和M1基因的保守序列，在潜在切点已确定的情况下，根据该切点附近的序列，按照碱基互补配对的原则，设计针对该切点的EGS结合区序列，在设计时应注意，切点的‑1位不能与EGS的碱基配对：靶RNA与EGS两侧结合区互补的序列之间应间隔2nt；EGS结合区序列至少具备12nt以尽量保证互补结合的特异性，所设计的全部EGS ，如EGS E‑PA, E‑PB1和E‑M1的结合区序列长度为14－16nt ，5’结合区和3’结合区序列的长度各为7‑9 nt；步骤三，EGS的人工合成：将设计好的EGS序列进行合成，合成时添加2’‑O‑methyl化学修饰，同时还合成了针对所设计的EGS的相应对照EGS (Control EGS，C‑EGS )作为对照试验，以无菌三蒸水将EGS冻干物溶解，并稀释至100uM，分装保存于‑20℃、‑80℃，备用；步骤四，合成的结果：根据序列通式5'‑U/CGNNNNNNU‑3'，在流感病毒八个基因片段中搜寻到100个左右潜在切点，此外， EGS中的T环中存在三个碱基的保守基序“TTC"，如果改变保守基序，其引导切割活性将大大降低，在正常EGS的基础上，分别将各EGS中的T环保守基序“TTC”全部变成“AAG"，以作为相应EGS的对照EGS (controlEGS，C‑EGS)，经过体外切割实验筛选到3个具有明显切割活性的EGS,分别命名为E‑PA,E‑PB1,E‑M1,它们分别位于PA,PB1,M1基因的15, 1224, 222位，根据这三个位点处附近的序列，设计相应的EGS。