[发明专利]大田蔷薇属植株上建立病毒诱导基因沉默体系的方法

摘要

本发明公开了一种大田蔷薇属植株上建立病毒诱导基因沉默体系的方法，涉及蔷薇属植物形状改良的基因工程领域，包括确定接种时期、配制侵染液、病毒载体的接种、接种后处理、基因沉默效率检验五个步骤，在侵染液的配制中提高了携带病毒载体的农杆菌的菌体浓度至OD600为1.5‑2.0，保证了在自然条件下接种区域内携带病毒载体的农杆菌具有足够的存活基数，提高了整个实验的侵染效率；在侵染液配制中加入低浓度Silwet‑77组分，既增加了植物材料表面的亲水性，提高了侵染液的侵染效率，同时低浓度的组分不会对植物材料产生毒害作用，且其污染率低，有利于环保；本方法既节省了成本又提高了基因沉默效率，处理样本的的基因沉默效率达到87.5%以上。

主权项

1.一种大田蔷薇属植株上建立病毒诱导基因沉默体系的方法，其特征在于，通过如下步骤实现：1）确定接种时期：3月中旬至4月中旬期间，接种时间为下午3点以后，提前查看天气预报，接种后一周之内确保无降雨；2）配制侵染液：侵染液现用现配，配制过程如下：首先，挑取带有相应病毒质粒的农杆菌阳性克隆于5mlLB或YEB液体培养基中，该培养基中含有kan 50ug/ml、利福平100ug/ml， 28℃条件下, 200r/min震荡10‑12h至浑独而不泛白；其次，分别再用50mlLB或YEB液体培养基培养，该培养基中含有kan 50ug/ml、利福平100ug/ml、 MES 10mM、AS 200uM ，28℃条件下震荡，在菌液浓度达到OD600为1.5‑2.0时取出；然后，离心收集菌体，均用25ml侵染缓冲液悬浮菌体，该侵染缓冲液以1/2MS液体培养基作为溶剂，其中含有MES 10mM、AS 100uM、MgC12 10mM，调节菌液浓度OD600到1.5‑2.0，形成农杆菌侵染缓冲液；最后，将含有等浓度pTRV1的农杆菌侵染缓冲液分别与含有pTRV2和pTRV2‑目的基因片段的农杆菌浸染缓冲液等体积混合,分别在两种混合好的液体中加入终浓度为0.01%的Silwet‑77，黑暗条件下室温静置4h，形成两种农杆菌侵染液；3）病毒载体的接种：采取锋利尖锐的器具将擦拭干净的当年生的整簇的小叶、小叶着生的叶柄以及叶片基部的小枝进行密集划伤，之后将整簇的小叶及其他有划伤的部位根据体积大小完全浸没在盛有侵染液的5ml或10ml离心管中进行侵染，单次侵染10‑15min，若天气较干燥或有风天气时侵染后的叶片表面水分蒸发较快，可再次侵染2‑5min，侵染完毕后挂牌注明处理组别及处理时间；4）接种后处理：每接种完一组上述小叶、叶柄及小枝，采用大号黑色塑料袋将接种区域连同其所在的整个枝条完全套住并将袋口封紧固定，黑色塑料袋24h之后即可去除，使接种区域接触正常的自然条件，如遇恶劣天气，适当延迟摘袋时间；5）基因沉默效率检验：组别包括病毒空载体组、病毒与目的基因复合载体组合未经处理的空白对照组，首先对上述三组样本进行表型观测，其次对所有组别经处理过的相应组织部位的植物材料提取RNA，合成第一链cDNA,进行PCR检测并通过琼脂糖凝胶电泳进行条带观测，以确定TRV病毒和目的基因的存在，最后通过计算PCR检测的有效数量与处理总数之间的比值来确定此次的基因沉默效率。