[发明专利]一种外源片段高效定点定向插入DNA病毒基因组的方法

摘要

本发明属于病毒基因重组技术领域，具体涉及利用非同源重组机制，将外源DNA片段定点、定向地高效插入特定大型DNA病毒基因组。本发明包括下列步骤：1)设计并构建针对DNA病毒基因组特定切割位点的CRISPR‑Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR‑associated protein 9)系统；2)设计并构建携带一个及以上相同切割位点的外源基因供体；3)将CRISPR‑Cas9系统表达载体和外源基因供体按照一定比例和顺序导入特定细胞；4)经过一段时间，根据病毒特性，选择合适的感染时间点和感染复数，将病毒感染细胞；5)选择优化的时间点收集病毒感染后产生的子代重组病毒；6)分离、筛选和鉴定目标重组子代DNA病毒。利用该方法能够显著提高外源基因定点定向插入DNA病毒基因组的重组效率，进而缩短重组病毒的构建和筛选时间。

主权项

1.一种外源基因片段高效定点定向插入DNA病毒基因组的方法，其特征在于包括下列步骤：1)设计并构建针对DNA病毒基因组特定切割位点的CRISPR‑Cas9系统；2)设计并构建携带有1个及以上能够被相同CRISPR‑Cas9系统识别的定向切割位点和外源基因片段组成的供体系统；3)将CRISPR‑Cas9系统表达载体和外源基因供体按照一定比例和顺序，选择适宜方法导入特定细胞；4)根据DNA病毒增殖特性，确定优化的感染时间点、感染复数并感染细胞；5)选择优化的时间点收集病毒感染后产生的子代重组病毒；6)分离、筛选和鉴定目标重组子代DNA病毒。