[发明专利]一种利用CRISPR/Cas9系统对水稻PHYB基因定点突变的方法

摘要

本发明涉及一种利用CRISPR/Cas9系统对水稻PHYB基因定点突变的方法，属于植物基因工程技术领域。本发明利用CRISPR/Cas9技术，对水稻光敏色素PHYB基因进行定向编辑，通过设计PHYB突变靶点、构建表达载体，并利用农杆菌介导法导入水稻，实现了对水稻PHYB基因的定点突变，该方法操作更加简单快捷、试验周期短，为快速创制抗旱和耐盐水稻新品种提供了一种简单有效的技术手段，对改良水稻性状和高产稳产育种具有重要实践意义。

主权项

1.一种利用CRISPR/Cas9系统对水稻PHYB基因定点突变的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)gRNA序列的选择：在PHYB基因第一外显子区域选择一段区域作为gRNA序列，所选gRNA序列为：5′‑TCCTCCACCGCATCGATGT‑3′；(2)gRNA序列的上下游引物的设计：根据步骤(1)中的gRNA序列设计引物如下：上游引物gRNA‑F：5′‑ggcgTCCTCCACCGCATCGATGT‑3′，下游引物gRNA‑R：5′‑aaacACATCGATGCGGTGGAGGA‑3′；(3)gRNA表达载体的构建：1)取所述上下游引物混合、退火，得双链DNA；2)用限制性内切酶对质粒进行酶切得到线性质粒；3)用T4DNA连接酶连接所述线性质粒和双链DNA得到连接产物；连接产物经转化、筛选得到表达载体；(4)将表达载体导入相应的浸染细菌中，得到含有CRISPR/Cas9‑gRNA质粒的浸染细菌，然后用含有CRISPR/Cas9‑gRNA质粒的浸染细菌侵染水稻愈伤组织；(5)将步骤(4)中的愈伤组织经诱导获得再生苗，筛选得到转基因阳性植株。