[发明专利]一种滑膜间充质干细胞的软组织构建方法及其应用

摘要

本发明涉及一种滑膜间充质干细胞的软组织构建方法，所述方法通过滑膜间充质干细胞的分离与培养、滑膜间充质干细胞的鉴定、软组织的培养与分离、软骨分化能力检测四个步骤简单有效地制造出软组织并对软骨分化能力进行检测，从而达到有效修复软骨的目的。其优点在于：(1)本发明所构建的软组织具有良好的软骨分化能力，可为软骨修复提供新的选择；(2)取样方便，易于检测，具有很好的应用前景。

主权项

1.一种滑膜间充质干细胞的软组织构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：(1)间充质干细胞的分离与培养：将标本用乙醇表面消毒，PBS缓冲液洗涤，置于培养皿中，用消过毒的手术剪刀将组织剪为小碎片，置于离心管中，加适量PBS缓冲液，离心，弃去上清，加入适量II型胶原酶，摇床振荡(200rpm，37℃)后，离心弃去胶原酶，最后在组织碎片中加入适量含10％FBS的低糖DMEM培养液，而后转移到培养皿中，置于培养箱中培养，两天后将组织块转移置新的培养皿中，继续培养两天而后弃去组织块，直到间充质干细胞长满培养皿；(2)间充质干细胞的鉴定：将细胞消化、重悬、离心、用PBS缓冲液洗涤，调整细胞密度为2×106/ml左右，取100μl待测细胞悬液，加入抗CD44、CD90、CD105以及CD45、CD34的单克隆抗体，避光常温反应30min，而后离心、弃上清，收集细胞，PBS缓冲液冲洗，多聚甲醛固定，最后上流式细胞仪检测标记物的表达情况；(3)软组织的培养与分离：将第三代间充质干细胞消化、计数，接种于12孔板中，1.2*106/孔，用含有0.3mMAsc‑2P的低糖DMEM培养液培养，2‑3天更换一次培养液，10‑14天后弃去培养液，而后用枪头沿着培养皿的边缘轻轻吹打至细胞层逐渐收缩形成一团软组织，将软组织置于滤纸上，除去培养基，用镊子轻轻夹起，检测软组织的弹性，将软组织置于多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，脱蜡，进行HE染色；(4)软骨分化能力检测：将软组织置于12孔板内，使用低糖DMEM培养1天使其充分贴壁，然后更换培养基为软骨培养基，置于培养箱中培养，隔几天更换一次培养液，培养结束后，利用RNA试剂盒提取纯化RNA，而后反转录，最后根据SYBRPremixExTaqTMII试剂盒的说明操作，并用荧光定量PCR仪检测ColII、SOX9以及AGN的表达。