[发明专利]一种ERG1基因缺陷酵母工程菌、其构建方法及其运用

摘要

本发明涉及一种ERG1基因缺陷酵母工程菌及其构建方法，所述ERG1基因缺陷型酵母工程菌通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对酵母进行改造，实现了Erg1基因序列的完全删除，避免了酵母自身修复产生的回复突变现象，得到一种可以适合验证其它来源鲨烯环氧化酶基因的工程菌。

主权项

1.一种雷公藤鲨烯环氧化酶基因功能验证方法，包括：分别将含有雷公藤鲨烯环氧化酶基因的表达载体pESC‑his‑Twse及相应不含雷公藤鲨烯环氧化酶基因的空载体pESC‑his转入到ERG1基因缺陷型酵母工程菌感受态细胞中，然后将所得感受态细胞涂布在“SC‑his+麦角固醇”固体培养基上，分别于有氧和无氧条件下培养，若有氧和无氧下，转入含雷公藤鲨烯环氧化酶基因表达载体的ERG1酵母缺陷菌均可生长，确认雷公藤中鲨烯环氧化酶基因具有生物学功能，其中所述ERG1基因缺陷型酵母工程菌感受态细胞是完全敲除了ERG1基因的酵母工程菌感受态细胞，所述雷公藤鲨烯环氧化酶基因序列如SEQ ID NO:1所示，所述酵母为BY4741酿酒酵母，并且所述ERG1缺陷型酵母工程菌的基因的敲除是采用CRISP/Cas9方法敲除，包括：(1)筛选酵母ERG1基因的gRNA位点，所述gRNA位点的基因序列为：TATCTTTTCACGTTTCAGAA；(2)构建敲除酵母ERG1基因的表达载体：以EGR1‑F和EGR1‑R为引物，以p426‑SNR52p‑gRNA真核表达载体为模板克隆得到线性载体，并以T4连接酶进行平末端连接，构建得到敲除酵母ERG1基因的gRNA表达载体，所述引物序列为：ERG1‑F：TATCTTTTCACGTTTCAGAAGTTTTAGAGCTAGAA，ERG1‑R：GATCATTTATCTTTCACTGCGGAGAAG；(3)改造Cas9载体，将p414‑TEF1p‑Cas9‑CYC1t的筛选标记TRP替换为LEU；(4)获取ERG1基因的双链DNA：设计敲除酵母ERG1基因的dsOligo，通过同源重组修复对目的基因进行敲除，ERG1‑Oligo‑F及ERG1‑Oligo‑R的序列为：ERG1‑Oligo‑F：CAGGTTATTTCGAACAATTGAAAAAAAAAAATCACAGAAAAACATATCGAGAAAAGGGTCCTACAGCTTATAAGGGAGAGAGGATAGGAACCGTCAAACATTAAGCTGCACCTTTTTTTT，ERG1‑Oligo‑R：AAAAAAAAGGTGCAGCTTAATGTTTGACGGTTCCTATCCTCTCTCCCTTATAAGCTGTAGGACCCTTTTCTCGATATGTTTTTCTGTGATTTTTTTTTTTCAATTGTTCGAAATAACCTG，所述酵母ERG1基因的dsOligo通过将ERG1‑Oligo‑F及ERG1‑Oligo‑R退火形成DNA双链，并回收纯化获得；(5)根据Frozen‑EZ Yeast Transformation II^TM试剂盒说明书制备酵母感受态细胞；(6)将步骤(2)中敲除酵母ERG1基因的gRNA表达载体、步骤(3)中改造好的Cas9载体以及步骤(4)中合成的酵母ERG1双链DNA转化至骤(5)中的酵母感受态细胞中，获得突变成功的ERG1基因缺陷的酵母菌。