[发明专利]一种快速筛选产生河豚毒素微生物菌株的方法及所用的地高辛标记DNA探针

摘要

本发明涉及海洋生物技术领域，尤其涉及一种快速筛选产生河豚毒素微生物菌株的方法及其所用的地高辛标记DNA探针，该方法使用的探针是与待测DNA碱基互补的254个碱基长度的单链DNA，探针3′端被地高辛标记。通过菌落原位斑点分子杂交，该探针可特异性检测待测菌株DNA样品中有否有河豚毒素合成sxt基因核酸的存在，筛选出产毒阳性菌株。本发明涉及的方法利用菌株DNA原位提取物进行菌落斑点杂交，可在8‑10小时内完成96个样品筛选。本发明的方法快速，特异性强且准确性高。

主权项

1.一种快速筛选产生河豚毒素微生物菌株的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)取待检测菌株单菌落点于硝酸纤维素膜制成待检膜，对待检膜进行预处理得到预处理DNA膜，将所得的预处理DNA膜置于杂交液中，在40～45℃条件下培育40～50min，得到预杂交液；2)将地高辛标记的DNA放入沸水中处理8～12min后置于冰浴中冷却，得到标记DNA溶液，取标记DNA溶液加入至步骤2)所得的预杂交液中配制混合液，所用标记DNA溶液与预杂交液的体积比5：(1.2～1.8)，混匀静置后将混合液中的膜体取出得到二次处理DNA膜；3)将步骤3)所得的二次处理DNA膜加入至杂交液中，并加入地高辛标记DNA探针，于40～45℃下作用45～60min，随后将膜去除放至盛有2×SSC溶液的容器中洗涤1～3次，每次3～7min，得到三次处理DNA膜4)将步骤4)所得的三次处理DNA膜置于缓冲液中清洗30～90s，弃去缓冲液再加入1～3％VOL的封闭液，室温放置40～70min，弃去封闭液再加入碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液，于35～39℃条件下温育20～30min，弃去碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液并用冲洗液冲洗2～6次，随后置于显色缓冲液中平衡90～150s，弃去显色缓冲液后加入BCIP/NBT显色液，置于暗处至显色后加入TE缓冲液终止反应，得到终处理DNA膜；5)将步骤5)所得的终处理DNA膜进行观察，有斑点出现表示结果为阳性，即为产生河豚毒素的微生物菌株，反之无斑点出现的表示结果为阴性。