[发明专利]一种高效便利定位基因插入座位的丝状真菌遗传转化系统及其应用

摘要

本发明公开了一种高效便利定位基因插入座位的丝状真菌遗传转化系统，是由Ti双元质粒pB01和含有pB01的宿主细胞构成；其中所述Ti双元质粒pB01是以pCMBIA1300质粒为骨架，由T‑DNA的左边界和右边界序列、草丁磷除草剂抗性基因表达盒、含有氨苄抗性基因表达盒和完整的广谱复制起始位点元件的质粒拯救系统的核心部件构成；含有pB01的宿主细胞是根瘤农杆菌菌株。本发明遗传转化系统的应用可弥补传统遗传转化系统存在的转化效率低、转化子遗传稳定性差、随机插入无法确实插入位点等缺陷，有助于对丝状真菌进行功能基因的标记以及标记基因的分离，将成为是最具潜力的开展真菌基因功能、真菌分子遗传学研究的有效方法。

主权项

1.一种含有拯救质粒核心部件的遗传转化系统在定位布氏白僵菌基因插入座位中的应用，其中，所述遗传转化系统由Ti双元质粒和含有Ti双元质粒的根瘤农杆菌宿主细胞构成；其特征在于：所述Ti双元质粒自上游至下游的连接顺序依次是：T‑DNA左边界（LB）序列、草丁磷除草剂抗性基因表达盒、拯救质粒核心部件、T‑DNA的右边界（RB）序列；其中所述T‑DNA左边界（LB）的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；所述草丁磷除草剂抗性基因表达盒自上游至下游依次由构巢曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶（gpdA）启动子、草丁磷除草剂抗性基因、构巢曲霉色氨酸C（trpC）终止子构成，其中gpdA启动子核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，草丁磷除草剂抗性基因核苷酸序列如SEQ ID No:4所示，trpC终止子核苷酸序列如SEQ ID No:5所示；所述拯救质粒核心部件自上游至下游由氨苄抗性基因表达盒和完整的广谱复制起始位点（ori）元件构成，其核苷酸序列如SEQ ID No:6所示；所述T‑DNA右边界（RB）序列如SEQ ID No:2所示；所述应用方法是：（1）含有拯救质粒核心部件的Ti双元质粒转化根瘤农杆菌；（2）根瘤农杆菌转化子筛选及验证；（3）含有拯救质粒核心部件的根瘤农杆菌转化布氏白僵菌；（4）布氏白僵菌转化子验证；（5）质粒拯救： 提取布氏白僵菌转化子基因组DNA； 采用EcoR I、Pst I这两种组合酶切基因组DNA，连接使其片段自连，连接液转化大肠杆菌；③ 筛选大肠杆菌转化子，提取质粒； 利用EcoR I和Hind III双酶切提取的质粒，验证是否含有拯救质粒核心部件；（6）测序获得插入位点序列信息：以拯救质粒核心部件上部分序列作为引物，将质粒拯救后所得质粒测序，登陆NCBI利用BLAST将测序结果与GeneBank中的已知序列进行比对，确定遗传转化系统在布氏白僵菌基因组中的基因插入座位。