[发明专利]一种选择性杀灭结肠癌细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法

摘要

本发明公开了一种选择性杀灭结肠癌细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法，通过将I型单纯疱疹病毒17+株基因组上的ICP4基因启动子置换成结肠癌特异性启动子、再将I型单纯疱疹病毒17+株基因组上ICP34.5基因剔除并插入IL‑12表达序列，得到HSV^CEA+IL‑12。本发明提供了一种选择性杀灭结肠癌细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法，该新型溶瘤病毒HSV^CEA+IL‑12采用CEA启动子及剔除ICP34.5的构建法实现高选择性地在结肠癌细胞内繁殖，确保该病毒不感染正常组织细胞；同时，插入IL‑12表达序列增强该新型溶瘤病毒HSV^CEA+IL‑12的免疫调节作用，确保受损的结肠癌细胞被机体自身的免疫细胞彻底清除干净。

主权项

1.一种选择性杀灭结肠癌细胞的新型溶瘤病毒构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、构建pdICP4‑promoter质粒：PCR分别扩增I型单纯疱疹病毒17+株ICP4基因启动子上游和下游的侧翼序列后，用限制性内切酶EcoRI/SpeI分别消化后获得ICP4基因启动子的上游侧翼序列、下游侧翼序列及去除ICP4启动子的I型单纯疱疹病毒17+株，并用互补的连接酶Linker 1和Linker 2将所述ICP4基因启动子的上游侧翼序列和下游侧翼序列连接起来，并把连接后的产物克隆到pBluescript的EcoRI和SalI酶切位点创建质粒pdICP4‑promoter；步骤二、构建pdICP4‑CEA‑promoter质粒：用EcoRI/XhoI双酶切消化的方式把由CMV启动子控制的人CEA启动子序列从质粒pcDNA3.1‑CEA‑promoter中释放出来，用T4DNA多聚酶处理后克隆入步骤一所得质粒pdICP4‑promoter的限制性内切酶EcoHV酶切位点处，从而构建质粒pdICP4‑CEA‑promoter；步骤三、BHK细胞内同源重组I型单纯疱疹病毒17+株：将步骤一中去除ICP4启动子的I型单纯疱疹病毒17+株与步骤二中质粒pdICP4‑CEA‑promoter共同转染BHK细胞，使这两者在BHK细胞发生同源重组，获得表达CEA启动子的重组病毒载体17‑d4‑CEA‑promoter；步骤四、构建pdICP34.5质粒：PCR分别扩增I型单纯疱疹病毒17+株中ICP34.5基因的上游和下游侧翼序列，得到的ICP34.5上游和下游侧翼序列两个片段用重叠PCR进行连接，随后把连接后的产物插入预先用限制性内切酶BamHI/XhoI消化后的质粒pSP72中，用T4DNA多聚酶补平质粒的粘性末端，得到的质粒命名为pdICP34.5；步骤五、构建质粒pdICP34.5‑hIL‑12：用hIL‑12基因替代质粒pcDNA3.1‑CEA‑promoter中的CEA‑promoter，产生质粒pcDNA3.1‑hIL‑12；把来自质粒pcDNA3.1‑hIL‑12中的hIL‑12表达盒克隆入质粒pdICP34.5的Afel位点处，创建质粒pdICP34.5‑hIL‑12；步骤六、步骤五中的质粒pdICP34.5‑hIL‑12用来删除步骤三中重组病毒载体17‑d4‑CEA‑promoter中ICP34.5基因，从而构建出溶瘤病毒HSVCEA+IL‑12。