[发明专利]一种从新鲜真菌菌丝体中快速提取长片段DNA的方法

摘要

本发明公开了一种从新鲜真菌菌丝体中快速提取长片段DNA的方法，包括菌体准备：取新鲜培养的真菌菌丝体，离心滤去水分后称取菌丝体，在液氮中迅速研磨成粉；细胞裂解：加入DNA提取缓冲液，加入60μL浓度为20mg/mL蛋白酶K，混匀后在65℃水浴30min；DNA提取：加入0.33mL浓度为KAc，冰浴20min，后酚:氯仿:异戊醇抽提，离心，取上清液加入无水乙醇沉淀，低温静置30min，离心收集沉淀；纯化处理：加入RNaseA，在37℃处理30min，后25:24:1的酚:氯仿:异戊醇和24:1的氯仿:异戊醇各抽提1次，低温离心5min；取上清液加入无水乙醇沉淀，挑取沉淀，漂洗，风干，溶于TE缓冲液中，保存备用。采用本方法提取的丝状真菌DNA量提高2倍，浓度达到277ng/μL，片段长≥20000bps，无降解，纯度高。

主权项

1.一种从新鲜真菌菌丝体中快速提取长片段DNA的方法，其特征在于：包括以下步骤：S101菌体准备：取新鲜培养的真菌菌丝体，快速离心滤去水分后称取菌丝体0.25g，在液氮中迅速研磨成粉；S102细胞裂解：加入1mL 65℃预热的DNA提取缓冲液，加入60μL浓度为20mg/mL蛋白酶K，快速振荡混匀，在65℃下水浴30min；S103DNA提取：加入0.33mL浓度为5mol/L KAc，冰浴20min，后加入0.5mL体积比例为25:24:1的苯酚:氯仿:异戊醇溶液抽提1次，在12000rpm下离心5min，取上清液，加入2.5倍体积的无水乙醇沉淀，混匀，低温静置30min，在5000rpm下离心收集沉淀，用质量浓度为75％的乙醇漂洗若干次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500μL TE缓冲液中；S104纯化处理：加入20μL浓度为10mg/mL RNaseA，在37℃处理30min，后用800μL体积比为25:24:1的酚:氯仿:异戊醇和800μL体积比为24:1的氯仿:异戊醇各抽提1次，在4℃，10000rpm下离心5min；取上清液，加入2.5倍体积的无水乙醇，在‑20℃沉淀30min，挑取沉淀，用质量浓度为75％的乙醇漂洗，风干，溶于500μL TE缓冲液中，在‑20℃保存备用。