[发明专利]一种提高铁皮石斛多糖含量的方法及采用该方法得到的铁皮石斛

摘要

本发明公开了一种提高铁皮石斛多糖含量的方法，属于基因工程领域，其步骤包括过表达DcUGP载体构建、菌种活化、侵染、共培养、抗性筛选和获得抗性植株等步骤；本申请利用农杆菌介导的方法，将DcUGP转入铁皮石斛中，获得了葡萄糖、蔗糖及多糖含量均高于野生型的铁皮石斛；本方法成本低、易操作，对缩短铁皮石斛育种年限，提高其品质具有重要意义。

主权项

1.一种提高铁皮石斛多糖含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)过表达DcUGP载体构建：a.根据已知的铁皮石斛的DcUGP cDNA序列，设计引物；b.提取铁皮石斛RNA反转录得到总cDNA，根据步骤(a)中设计得到的引物进行PCR扩增得到DcUGP目的片段；c.用SpeI与AscI限制内切酶对载体pFGC1008与步骤(b)得到的DcUGP目的片段进行酶切；d.将步骤(c)酶切后的DcUGP目的片段与载体pFGC1008进行电泳检测，对所需片段进行回收；将回收产物加入连接酶进行连接反应，得到连接产物pFGC1008‑DcUGP；e.将步骤(d)所得的连接产物pFGC1008‑DcUGP转化大肠杆菌后，提取质粒pFGC1008‑DcUGP并验证；(2)pFGC1008‑DcUGP转化农杆菌GV3101将步骤(1)所得的质粒pFGC1008‑DcUGP转化农杆菌GV3101，然后进行克隆PCR，进行农杆菌验证；(3)菌种活化：活化含有pFGC1008‑DcUGP的保存农杆菌GV3011，制成侵染液；(4)侵染：选取生长健壮、颜色较绿且较致密的铁皮石斛野生型原球茎并切割，然后加入步骤(3)所得侵染液，进行侵染；(5)共培养：将步骤(4)侵染后的原球茎转入共培养基上进行共培养；(6)抗性筛选：将步骤(5)共培养后的原球茎转移至筛选培养基进行抗性筛选，至分化出新的原球茎，即完成抗性筛选；(7)植株再生：将步骤(6)所得的新的原球茎转移至不含潮霉素的培养基，待其分化出芽后，转入生根培养基中生根，获得完整植株。