[发明专利]甘蔗原生质体超低温保存方法

摘要

本发明公开了甘蔗原生质体超低温保存方法，以甘蔗幼叶用2％纤维素酶+0.5％果胶酶+0.1％离析酶+0.3％半纤维素酶的酶液常温酶解4h，采用65％～75％的KM8P培养基+20％的小牛血清蛋白+5％～15％的二甲基亚砜作为冻存液，将装有细胞悬液的冻存管首先放入4℃中40min，之后置于‑20℃中30～60min，再置于‑80℃放置过夜，最后置于‑80℃冰箱中或‑196℃液氮罐中保存；解冻复苏为取出冻存管放入37℃的恒温水浴锅中不断摇晃致解冻，然后离心弃掉冻存液，用含9％甘露醇清洗3遍，用KM8P培养基培养得到得到保存后的原生质体。本发明方法能优化甘蔗原生质体冻存条件、降低冻存液的毒性作用，改善冻存效果，最大程度保留原生质体的生物学特性、保证甘蔗遗传稳定性，提高保存后的复苏活力。

主权项

1.甘蔗原生质体超低温保存方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)甘蔗幼叶的酶解：以甘蔗尾鞘作为幼叶酶解材料，先剥去外面2～3层叶鞘，然后用质量浓度75％的酒精灭菌30s，再用无菌水清洗3次后，切除外层和两端叶鞘，漏出淡黄色心叶，并留下生长点以上1～5cm嫩叶，切成厚度为1mm的薄片，收集幼叶0.5g，加入5mL质量浓度13％的甘露醇溶液，使材料质壁分离0.5～1h后，除去所述甘露醇溶液，加入5mL酶液常温酶解4h，然后分别过100目和200目细胞筛，收集原生质体悬浮液，梯度离心纯化原生质体，所得原生质体为幼叶原生质体；(2)冻存：采用65％～75％的KM8P培养基+20％的小牛血清蛋白+5％～15％的二甲基亚砜作为冻存液，将步骤(1)所得的原生质体按细胞密度1×106个/mL悬浮于所述冻存液中，每只冻存管内放细胞悬液200μL，采用缓慢冻存的方法，即将装有细胞悬液的冻存管首先放入4℃中40min，之后置于‑20℃中30～60min，再置于‑80℃放置过夜，最后置于‑80℃冰箱中或‑196℃液氮罐中保存；(3)解冻复苏：采用快速化冻的方法，即从步骤(2)所述冰箱中或液氮罐中取出冻存管放入37℃的恒温水浴锅中不断摇晃致解冻，然后离心弃掉冻存液，用含9％甘露醇清洗3遍，用KM8P培养基培养得到得到保存后的原生质体。