[发明专利]一种利用南方红豆杉菌根菌与活组织细胞共培养生产紫杉醇及10-DABⅢ的方法

摘要

一种利用南方红豆杉菌根菌与其活组织细胞共培养生产紫杉醇及10‑DABⅢ的方法，包括步骤：1）南方红豆杉菌根诱导与采集；2）菌根菌分离培养基的配置；3）菌根菌分离培养筛选菌株（E20）；4）菌株复壮；5）液体菌种培养；6）预备南方红豆杉活组织细胞；7）E20菌株与南方红豆杉离体活组织细胞密闭避光共培养；8）提取纯化。本发明通过自主从南方红豆杉菌根中分离筛选获得的E20菌株与南方红豆杉活枝叶细胞、愈伤组织细胞离体共培养，利用两者离体重建共生互作关系过程实现持续、稳定地提高体系紫杉醇及10‑DABⅢ产率，可使10‑DABⅢ和紫杉醇的含量提高。操作简单、环保、效率高。

主权项

1.一种利用南方红豆杉菌根菌与其活组织细胞共培养生产紫杉醇及10‑DABⅢ的方法，其特征在于，包括如下步骤：1）南方红豆杉菌根诱导与采集：于春夏之间，对红豆杉林地进行浅挖中耕松土，割取杂草覆盖在林地之上，厚度约5～10 cm，于10月～11月采挖菌根；2）菌根菌分离培养：采用26271固体培养基，从南方红豆杉菌根中分离获得多种菌根菌，再分别采用26271液体培养基进行单菌株纯发酵培养，采用HPLC及HPLC/MS对发酵液及菌丝体中紫杉醇及10‑DABⅢ的含量进行检测，筛选出具有较高产紫杉醇及10‑DABⅢ能力的菌株，记为E20菌株（真菌，代号为自拟，具有较高产紫杉醇及10‑DABⅢ的能力，种类待鉴定），冷藏保存；3）26271固体培养基为自主研发试配出的专用培养基，其组成与配置过程为：1/2 MS大量＋MS（微量、无激素有机、铁盐）＋0.5 g L‑1酵母浸膏＋1 g L‑1水解酪蛋白＋100 mL土豆煮滤液＋30 g L‑1蔗糖＋7～14 g L‑1琼脂；培养基经煮化调pH 5.8～7，经121℃高压蒸汽灭菌30 min，摆斜面，待凝固后于室温下搁置后熟7天以上，备用；4）土豆煮滤液：切取已削皮的马铃薯置于自来水中，用小火煮沸30min，然后滤出汁液；5）26271液体培养基：1/2 MS大量＋MS(微量、无激素有机、铁盐)＋0.5 g L‑1酵母浸膏＋1 g L‑1水解酪蛋白＋100 mL土豆煮滤液＋30 g L‑1蔗糖；调pH 5.8～7， 121℃高压蒸汽灭菌，备用；6）E20菌株复壮：将冷藏保存的菌种无菌分转接到新配制的26271固体培养基的斜面上，于23℃～28℃下复壮培养5～7天；7）液体菌种培养：取复壮后的E20菌株转入盛有29271液体培养基的容器中，120 rpm·min‑1、23℃～28℃条件下，振荡培养3～5天，至生长旺盛期，作为生产接种用；8）南方红豆杉枝叶采集与预处理：于秋冬季剪取南方红豆杉当年生枝叶，捣碎，使成为2mm～5mm的碎片；9）E20菌株与南方红豆杉离体活枝叶组织细胞进行密闭避光培养：将经上述处理过的南方红豆杉活枝叶，按10～20%的比例接入上述培养的E20液体菌种，拌匀后于温度23℃～28℃，湿度50%～70%下，密闭，避光，共培养7～10天；10）提取纯化：将经上述发酵处理后的南方红豆杉枝叶，40℃烘干后即刻粉碎，过60目筛，然后加入10倍体积的甲醇，超声辅助提取30 min，将提取液于40 ℃下减压浓缩至干，然后加入适量体积的甲醇复溶，并加等体积石油醚萃取，萃取，收集甲醇相，于40 ℃减压浓缩至干，加适量体积二氯甲烷复溶，并以二氯甲烷︰水=2︰1（V/V）进行萃取，弃去水相，收集二氯甲烷相，40 ℃减压浓缩，用适量甲醇充分洗出浓缩固形物，并稀释至适当浓度，采用高效液相制备色谱进行分离，即根据相同条件下采用高效液相色谱检测时紫杉醇与10‑DABⅢ的出峰保留时间设定样品自动收集模式进行样品收集，然后进行浓缩结晶即可得到紫杉醇和10‑DABⅢ两种目标化合物的较高纯品。