[发明专利]一种稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株的构建方法在审
| 申请号： | 201810991320.6 | 申请日： | 2018-08-29 |
| 公开（公告）号： | CN108949697A | 公开（公告）日： | 2018-12-07 |
| 发明（设计）人： | 张宇良;牛敏;郭慧娜;薛绪亭;郑希望;王斌全;高伟;吴勇延;卢岩;李会政;李文奇;代丰升;代力;殷宏雨;汤叶美;周江韬;刘红亮 | 申请（专利权）人： | 山西医科大学第一医院 |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C12N15/867 |
| 代理公司： | 太原申立德知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 14115 | 代理人： | 郭海燕 |
| 地址： | 030001 *** | 国省代码： | 山西;14 |
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| 摘要： | 本发明属于细胞研究技术领域，具体涉及一种稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株的构建方法。本发明稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株的构建方法，包含以下步骤：(1)设计并合成引物；(2)根据绿色荧光蛋白的基因序列和pLenti‑puro序列，用BamHI和XhoI酶切绿色荧光蛋白的基因序列和pLenti‑puro载体质粒，将酶切产物连接，获得目的载体pLenti‑puro‑GFP；(3)无内毒素提取验证载体pLenti‑puro‑GFP质粒，用BamHI和XhoI酶切载体pLenti‑puro‑GFP质粒，琼脂糖凝胶电泳电泳检测基因序列大小，同时将载体pLenti‑puro‑GFP质粒送去测序检测GFP‑LC3的序列情况；(4)用载体pLenti‑puro‑GFP质粒及慢病毒包装载体共转染293T细胞，收取病毒上清，将病毒上清转染喉癌细胞Hep‑2，感染24h后加入含有嘌呤霉素的培养基，筛选细胞，并在高内涵下观察，直至获得稳定株。 | ||
| 搜索关键词： | 绿色荧光蛋白 质粒 喉癌细胞株 基因序列 稳定表达 构建 琼脂糖凝胶电泳 内毒素 病毒 细胞 包装载体 测序检测 电泳检测 合成引物 喉癌细胞 酶切产物 细胞研究 载体质粒 嘌呤霉素 培养基 共转染 慢病毒 转染 验证 筛选 感染 观察 | ||
【主权项】：
1.一种稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株的构建方法，其特征在于包含以下步骤：(1)根据绿色荧光蛋白基因的序列信息，设计并合成引物，以pEGFP‑C1载体质粒为模板，PCR扩增获得绿色荧光蛋白的基因序列；(2)用BamHI和XhoI酶切绿色荧光蛋白的基因序列和pLenti‑puro载体，将酶切产物连接，获得pLenti‑puro‑GFP质粒；(3)无内毒素提取pLenti‑puro‑GFP质粒，用BamHI和XhoI酶切pLenti‑puro‑GFP质粒，琼脂糖凝胶电泳检测序列大小，同时将pLenti‑puro‑GFP质粒送测序检测序列准确性；(4)用pLenti‑puro‑GFP质粒及慢病毒包装载体共转染293T细胞，收集病毒上清，将病毒上清感染Hep‑2细胞，感染24h后加入含有嘌呤霉素的培养基，筛选细胞，并在倒置荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白表达情况，直至获得稳定表达绿色荧光蛋白的细胞株。
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