[发明专利]一种优化LPOR蛋白结晶的方法

摘要

本发明公开了一种优化LPOR蛋白结晶的方法，具体包括LPOR蛋白表达、LPOR蛋白纯化、TEV酶切、Ni亲和层析、分子筛和结晶过程。本发明提供了一种优化结晶LPOR蛋白的方法，从而提高LPOR蛋白晶体的质量，优化LPOR蛋白晶体的衍射率，达到对LPOR蛋白的结构进行解析的目的，为其他光敏感超速蛋白的结构解析奠定了基础；同时对彻底阐明和确定光敏感超速蛋白的催化机理或将其工程化奠定了基础。

主权项

1.一种优化LPOR蛋白结晶的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)LPOR蛋白表达将质粒pEBSRC‑TEV‑LPOR转入宿主细胞中，挑取单克隆进行筛选和接种，培养3‑6h后，加入IPTG诱导过夜，后离心收集菌体，并利用bufferⅠ悬浮菌体；(2)LPOR蛋白纯化将步骤(1)中得到的菌体悬浮液进行破碎，离心后得上清液，并将上清液经Ni亲和层析柱，并用bufferⅠ平衡纯化柱，之后分别用bufferⅡ、bufferⅢ和bufferⅣ冲洗纯化柱，并将每一个洗脱下来的蛋白峰分别收集，以待SDS‑PAGE验证；其中LPOR被bufferⅢ洗脱，收集bufferⅢ洗脱蛋白；(3)TEV酶切将步骤(2)中得到的蛋白进行酶切除去His标签，并利用SDS‑PAGE检验酶切效率；(4)Ni亲和层析将步骤(3)中得到的酶切后的蛋白液进行离心除去沉淀，过滤后进行上样，并收集流穿中的蛋白；(5)分子筛将步骤(4)中得到的蛋白进行浓缩后上样，利用GF buffer冲柱，并分别收集每一个蛋白峰，以待SDS‑PAGE验证；(6)蛋白浓缩结晶将骤(5)中得到的蛋白进行超滤浓缩，得到浓度为30mg/mL的蛋白，利用50ul LMB1 A7添加10ul additive screen 10作为结晶缓冲液，之后进行点晶得到LPOR蛋白晶体。