[发明专利]一种LPOR蛋白的表达纯化方法

摘要

本发明公开了一种LPOR蛋白的表达纯化方法，具体包括LPOR蛋白的表达方法和LPOR蛋白的纯化方法，其中LPOR蛋白的表达方法包括：筛选LPOR基因的DNA序列、DNA序列的扩增、双酶切、LPOR表达载体构建、LPOR表达载体的筛选和LPOR蛋白表达；其中LPOR蛋白的纯化方法包括：His‑tag亲和层析、蛋白浓缩和凝胶过滤。本发明提供了一种LPOR蛋白的表达纯化方法，使得LPOR蛋白具有较高的活性，为其他光敏感超速蛋白的表达纯化提供实验技术，为光敏感超速蛋白的结构解析奠定基础；同时对彻底阐明和确定光敏感超速蛋白的催化机理或将其工程化奠定了基础。

主权项

1.一种LPOR蛋白的表达方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)筛选LPOR基因的DNA序列根据genebank中公布的LPOR蛋白的核苷酸序列NC_004113设计引物，并在所述引物两端加入BspHI/BamHI酶切位点，从所述NC_004113序列中筛选LPOR基因的DNA序列为SEQ ID NO 3，并选择原核表达载体；其中所述引物序列为LPORN：5’‑TCATGAATGAGTGATCAGCCACG‑3’；SEQ ID NO 1；LPORC：5’‑GGATCCGGCCAATCCCACCAGTTTTTC‑3’；SEQ ID NO 2；(2)将步骤(1)得到的LPOR基因的所述DNA序列进行PCR扩增；(3)双酶切将步骤(2)得到的PCR产物纯化后分别用BspHI/BamHI双酶切，同时将所述原核表达载体用BspHI/BamHI双酶切，回收酶切后的PCR产物和原核表达载体大片段；(4)LPOR表达载体构建将步骤(3)得到酶切后的PCR产物和原核表达载体大片段，按10:1‑5:5的比例混合连接，并将得到的连接产物转入感受态细胞中，得到LPOR表达载体；(5)LPOR表达载体的筛选将步骤(4)得到的所述LPOR表达载体挑取在筛选平板培养基上培养，挑取阳性单克隆，提取质粒，酶切验证正确后测序确认；将测序结果正确的LPOR表达载体保存备用。(6)LPOR蛋白表达将步骤(5)中构建好的LPOR表达载体转入原核表达菌株中，在25‑37℃下培养24‑48h，加入诱导剂表达LPOR蛋白。