[发明专利]一种可静脉注射的溶瘤病毒制剂及其制备方法

摘要

本发明涉及一种可静脉注射的溶瘤病毒制剂及其制备方法,本发明将靶向多肽基因转染真核细胞，并将靶向多肽展示到细胞膜上，获得稳定表达靶向多肽的基因工程改造细胞株后，利用该细胞株提取尺寸均一的纳米级细胞膜囊泡，再将溶瘤病毒(OV)装载到工程改造的细胞膜囊泡里，合成可静脉注射同时靶向肿瘤递送的溶瘤病毒复合体。本发明将溶瘤病毒装载在细胞膜囊泡里面，能够有效降低机体里中和抗体对溶瘤病毒的中和作用，同时细胞膜囊泡经过基因工程改造后具有靶向性，能够实现溶瘤病毒的靶向递送和在肿瘤部位的富集，同时降低溶瘤病毒的全身性副作用。

主权项

1.静脉注射的溶瘤病毒疫苗的制备方法，包括以下步骤：1)通过基因转染的方法，将靶向多肽基因转入真核细胞中，并通过靶向多肽基因中的信号肽将靶向多肽表达到细胞质膜上；2)转染24h后，使用500～550μg/ml的G418，对转染的真核细胞进行筛选，每3～5天更换一次筛选培养基；筛选，至有抗性的克隆出现，停药培养，待克隆逐渐增大；3)挑取克隆团簇的细胞，胰酶消化后，将细胞通过有限稀释法接种到细胞培养皿中，加入200～250μg/ml的G418对细胞维持筛选；4)待单克隆细胞增大后，将其扩大培养，并重复步骤(3)的有限稀释法进一步筛选稳定表达细胞株，经过多代的筛选获得能够稳定表达靶向多肽的细胞株；5)取稳转细胞株进行扩大培养，挑选生长对数期的细胞，PBS洗涤3～5次之后，加入含有PMSF蛋白酶抑制剂的低渗缓冲液，充分浸润细胞；6)将细胞收集起来，充分震荡细胞使其均匀分散，将细胞悬液置于1‑5℃下旋转混悬，使细胞充分破裂形成大量细胞膜囊泡；7)细胞混悬液在500～800×g下离心5～15min，将上清转移到新的离心管中，5000～8000×g下离心5～15min，最后将上清移到新的离心管，50000～80000×g下离心50～70min，移除上清，细胞膜沉淀用400～600ul缓冲液重悬，获得细胞膜囊泡，‑80℃保存备用；8)将溶瘤病毒与细胞膜囊泡混合均匀，混合液用脂质体挤压器在350‑450nm孔径的薄膜下来回挤压不少于15回合，进而将薄膜换成150‑250nm孔径薄膜，继续来回挤压不少于15回合，直至将溶瘤病毒颗粒装载进细胞膜囊泡的空腔里，形成尺寸均一的细胞膜囊泡包裹溶瘤病毒，‑80℃保存备用。