[发明专利]一种包载蛋白的外泌体的制备方法与应用

摘要

本发明提供了一种包载蛋白的外泌体的制备方法与应用。所述的外泌体制备方法采用重组表达外源目的蛋白的方法，包括蛋白的瞬时表达和稳定表达，通过工程化大规模培养细胞的手段，获得大量包含外源目的蛋白的外泌体。本发明的培养过程不需要添加血清，免除了外泌体提取过程中血清囊泡的污染；通过规模培养细胞来获取大量装载具有生物活性抗体的外泌体，为外泌体的产业化提供了可能性，具有良好的产业化前景。同时，通过本发明的制备方法所得到的外泌体包载了活性蛋白，可以更易于透过组织和细胞膜，以及血脑屏障，到达病灶部位用于肿瘤等疾病的治疗；也可以用于护肤品，更易于透过皮肤，应用广泛。

主权项

1.一种包载蛋白的外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)构建含有外源目的蛋白基因片段的重组表达载体，(2)将所述的重组表达载体转染细胞进行表达，培养转染后的细胞，使细胞分泌载有所述外源目标蛋白的外泌体；①当所述的表达为瞬时表达时，具体步骤为：A.细胞的培养：将培养至对数生长期的细胞以细胞接种后最终浓度为4×105～6×105个/mL接种到培养基中，在36～38℃，3～7％CO2，转速160～200rpm下于Tubespin管振荡悬浮培养60～84h，扩增到1L培养摇瓶中细胞活率维持在90％左右；B.将所述的重组表达载体转染细胞，转染后的细胞在36～38℃，4～8％CO2，转速160～200rpm下悬浮培养，当细胞活率低于30％终收样；②当所述的表达为稳定表达时，具体步骤为：A.将所述的重组表达载体转染细胞，培养当天细胞活率大于90％在克隆培养基中培养，在第12～14天用ELISA方法测定蛋白表达情况，选出表达量高的克隆扩增至12孔板；在第12～14天再次用ELISA方法测定蛋白表达情况，筛选出高表达克隆到Tubespin管培养，得到表达量高的稳定表达细胞；B.表达量高的稳定表达细胞的大规模培养：将培养至对数生长期的细胞以细胞接种后最终浓度为4×105～6×105个/mL接种到培养基中，在36～38℃，3～7％CO2，转速160～200rpm下于Tubespin管振荡悬浮培养60～84h，扩增到1L培养摇瓶中，培养60～84h后转移到5L发酵罐中，培养60～84h后转移到20L发酵罐中，培养60～84h后转移到200L发酵罐中；(3)从细胞培养上清分离得到所述的外泌体。