[发明专利]SDS-PMA-qPCR法检测乳中无乳链球菌活菌的方法

摘要

本发明涉及乳样中致病菌检测技术技术领域，是一种SDS‑PMA‑qPCR法检测乳中无乳链球菌活菌的方法，其按下述步骤进行：第一步，待测乳样SDS‑PMA处理，第二步，DNA提取，第三步，qPCR扩增反应，第四步，结果测定。本发明方法在提取DNA之前，能够更好地提取DNA，提高本检测方法的灵敏性，在用PMA处理菌体之前，使用SDS能增强PMA对菌体的渗透性，并且合适的SDS浓度能够有效促进PMA对死菌的渗透效果，二者结合能够精确区分无乳链球菌活细胞和死细胞，总之，本发明方法不受待测乳样中无乳链球菌死菌的干扰，能够准确检测出并定量乳中无乳链球菌的具体含菌量，并且特异性高，可以避免假阳性结果。

主权项

1.一种SDS‑PMA‑qPCR法检测乳中无乳链球菌活菌的方法，其特征在于按下述步骤进行：第一步，待测乳样处理：将待测乳样摇匀，取2mL乳样于EP管中，然后向其中加入SDS母液104μg/mL4μL、加入终浓度为10mg/mL的PMA 2μL得到混合物A，接着将混合物A于40℃恒温培养箱中避光培养20min，避光培养完成后，继续将混合物A放入冰水混合铁桶内浮漂开盖、用500W钨丝灯照射10min，照射完成后，将混合物A于1000rpm离心10min得到沉淀A，用1mL生理盐水洗涤沉淀A，再次离心5min得到沉淀B，用1.9mL TE buffer对沉淀B进行重悬得到悬浮液A，向悬浮液A中加入100μL终浓度为10mg/mL的溶菌酶，置于37℃恒温培养箱培养30min至60min后，于1000rpm离心10min得到沉淀C；第二步，DNA提取：向沉淀C中加入1mL 2％CTAB裂解液后用移液枪轻吹重悬得到悬浮液B，向悬浮液B加入200mg玻璃珠后密封，进行研磨两次，然后向其中加入20μL蛋白酶K得到混合物B，将混合物B放入55℃水浴30min，每隔5min混匀一次，再70℃水浴20min，每隔5min混匀一次，接着将水浴后的混合物B于14000rpm离心5min，移取上清液、弃掉沉淀，得到上清液A，向上清液A中加入等体积的DNA提取液得到混合物C，将混合物C于14000rpm离心5min，移取上清液、弃掉沉淀，得到上清液B，向上清液B中加入等体积的DNA提取液得到混合物D，将混合物D于14000rpm离心5min，移取上清液、弃掉沉淀，得到上清液C，向上清液C中加入体积为上清液C0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀得到混合物E，将混合物E于14000rpm离心5min，弃去上清液，留取沉淀，得到沉淀D，用1mL 70％乙醇洗涤沉淀D，并于14000rpm离心10min，弃去上清，留取沉淀，得到沉淀E，将沉淀E于滤纸上干燥20min至30min，挥发乙醇，最后向沉淀E中加入100μL TE buffer重悬溶解DNA得到模板DNA；第三步，qPCR扩增反应：首先准备引物序列，然后配制qPCR总反应体系，qPCR总反应体系的体积为25μL，qPCR总反应体系包括12.5μL Master Mix、模板DNA 2μL、引物序列中上游引物1μL、引物序列中下游引物1μL、二次蒸馏水8.5μL，配制好qPCR总反应体系后用Nanodrop 1000分光光度计测其中DNA浓度，接着将qPCR总反应体系在如下反应程序下进行30个循环反应：94℃预变性2min，94℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸1min；第四步，结果测定：用CFX Manager 3.1计算得到标准曲线，将Cq值换算称logCFU值得到乳中无乳链球菌含量，达到定量结果。