[发明专利]一种小反刍兽疫V蛋白原核和真核表达、纯化和单抗的制备方法

摘要

本发明公开了一种小反刍兽疫V蛋白原核和真核表达、纯化和单抗的制备方法，包括以下步骤：小反刍兽疫病毒V基因原核表达载体构建pGEX–4T–V；重组pGEX–4T–V蛋白SDS–PAGE和western–blot鉴定；pGEX–4T–V蛋白纯化和浓度测定；重组pGEX–4T–V蛋白免疫小鼠制备单抗；单抗腹水的制备；小反刍兽疫V基因一个片段（已知序列）的多肽合成制备单抗；真核表达小反刍兽疫V蛋白；三株单抗间接免疫荧光和抗体分型试验等。本发明为小反刍兽疫基因工程疫苗的诊断奠定可靠的技术保障和支撑。

主权项

1.一种小反刍兽疫V蛋白原核和真核表达、纯化和单抗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(一)Nigera75/1疫苗毒V基因的引物设计：根据NCBI序列号码：X74443下载V基因序列，897bp；应用DNAStar软件分析，设计上游和下游引物序列的酶切位点；上游酶切位点为EcoRI，下游酶切位点为SmaI；下游引物加HA标签，HA序列如SEQ:ID:NO:1所示，HA标签反转录序列如SEQ:ID:NO:2所示；根据Oligo 7软件设计V基因引物，上游引物P1：如SEQ:ID:NO:3所示；下游引物加HA如SEQ:ID:NO:4所示，,突变引物M1如SEQ:ID:NO:5所示，突变引物M2如SEQ:ID:NO:6所示；(二)Nigera75/1疫苗毒RNA的提取：TRIzol LS提取法：提取物为细胞培养液毒，提取时所用一切物品均无RNA酶；1、在1.5ml的eppendorf管中加入病毒原液250ul，再加入TRIzol LS 750ul，充分混匀，室温放置5min；2、加入200ul的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管，溶液充分乳化，成乳白状，无分相现象，室温放置3min；3、4℃，12000r/min离心15min，取上层液相移入另一管)；4、加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min；5、4℃，12000r/min离心10min，用枪小心吸去所有上清；6、加1ml75％乙醇洗一遍，4℃，8000r/min离心10min，用枪小心吸去所有上清，在室温干燥5min；7、加入25ul DEPC处理水，立即进行PT–PCR扩增；(三)RT–PCR扩增Nigera75/1疫苗毒V基因以提取的2.5uLRNA溶液做模板，按照宝生物公司的RT–PCR试剂盒进行加样，应用P1和M2、P2和M1为引物进行RT‑PCR扩增；反应体系：2×Buffer 25uL，上下游引物各1uL，RNA模板2.5uL，酶1uL，水19.5uL，总体系50uL；反应程序为：50℃30min，94℃2min，94℃45s，55℃30s，72℃1min，35个循环，72℃10min；用1％的琼脂糖凝胶电泳进行RT‑PCR产物分析；P1和M2引物扩增的片段大小为705bp，命名为N1；P2和M1引物扩增的片段大小为220bp，命名为N2；(四)融合PCR扩增以P1和P2为引物，N1和N2为模板进行PCR扩增；反应体系：10×Buffer 5uL，上下游引物各1uL，模板N1和N2各0.35uL，Ex Taq酶0.3uL，dNTP4uL，水38uL，总体系50uL；反应程序为：94℃5min，94℃45s，55℃30s，72℃1min，35个循环，72℃10min；用1％的琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分析；目的片段V基因大小924bp；(五)PCR产物胶回收和纯化应用上海生物工程有限公司的胶回收纯化试剂盒，回收和纯化PCR扩增的V基因；(六)分别单酶切V基因和pGEX–4T–1载体质粒SmaI 30℃过夜酶切V基因和pGEX–4T–1载体质粒，回收纯化后应用EcoRI37℃单酶切V基因和pGEX–4T–1载体质粒；(七)双酶切后的V基因和pGEX–4T–1载体质粒胶回收和纯化应用上海生物工程有限公司的胶回收纯化试剂盒，回收和纯化上述(六)V基因和pGEX–4T–1载体质粒，–20℃保存备用；(八)V基因和pGEX–4T–1载体的连接和转化1、双酶切后的V基因和pGEX–4T–1载体质粒进行连接和转化；2、连接产物转化；全部的连接产物和0.5uL pGEX–4T–1载体质粒分别加入到50uL大肠杆菌感受态细胞DH5α过4μL)中；冰浴30min后，42℃热激90s，冰浴2min；加900uL无抗性LB培养基，于37℃摇床慢摇振荡培养60min；离心后取50‑100uL涂在含有氨苄青霉素100μg/mL的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜；(九)重组质粒pGEX–4T–V的提取和鉴定(十)载体质粒pGEX–4T–1和阳性重组质粒pGEX–4T–V转化到表达的大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中转化、挑菌、质粒提取如前(八)和(九)所述的具体的方法；(十一)重组pGEX–4T–V蛋白SDS–PAGE鉴定将阳性重组菌按照1％接种到5mL含氨苄青霉素100μg/mL的LB液体培养基里，37℃、250rpm/min摇菌过夜；第二天保存菌种到50％的甘油里，按照2％接种到10mL LB液体培养基，摇菌2个小时测菌液OD值在0.6～0.8之间加1mM/mLIPTG诱导表达蛋白，加诱导剂之前取1mL菌液做阴性对照；诱导表达4小时后，取菌液到10mL离心管里，离心弃掉上清，用PBS洗涤一次；用2mL的PBS溶解，超声破碎，超声4s，间隔5s，超声25次；12000rpm/min离心10min，分装上清和用500uLPBS溶解沉淀；取诱导后沉淀和上清各60ul溶解在4倍的上样缓冲液中，同时取诱导后的载体沉淀和上清做阴性对照，沸水中煮沸5min，上样10ul进行SDS–PAGE；(十二)western–blot鉴定SDS–PAGE之后1块胶进行转膜，使用PVDF膜，转移液提前2小时放入到–20℃保存备用；取出来的胶用去离子水冲洗，放入到转移液里；剪比蛋白胶大一点的滤纸6层，放入到转移液中；浸泡黑色的海绵到转移液里，再放到转膜曹里；浸泡的滤纸放到海绵上；蛋白胶放在滤纸上，浸泡在甲醇里膜放在胶上；浸泡的另外3层滤纸放在膜上；赶走多余的气泡，放入浸泡过的黑海绵；整体夹紧放入转膜曹里，倒入转移液和放冰袋，100V 1小时；拿出转移好的膜，PBST洗涤3次，每次3min；用5％的脱脂奶粉4℃封闭过夜；PBST洗涤3次，加抗HA标签的单抗1:150，室温摇床孵育2小时；PBST洗涤3次，加抗鼠的二抗1:2500，室温摇床孵育2小时；PBST洗涤3次，显色；显色液配方：1ml去离子水，0.01克氯化镍，9ml 20mM pH7.6的This‑HCl，0.006克DAB，10ul30％双氧水；显色后晾干观察结果；(十三)pGEX–4T–V蛋白纯化诱导表达300ml pGEX–4T–V重组菌；离心，沉淀用PBS洗涤1次；用6mlPBS溶解沉淀，超声4s，间隔5s，超声30次；12000rpm/min离心15min，上清2ml/管分装到EP管里；使用GE公司的GST重力柱按照说明书的步骤进行纯化表达的蛋白为免疫小鼠做准备；(十四)纯化的蛋白浓度测定应用上海生物工程有限公司的BCA法蛋白质浓度测定试剂盒，测定纯化的蛋白浓度，然后免疫Balb/c小鼠；(十五)小鼠免疫纯化的蛋白3.00mg/mL，以0.1mg/mL与弗氏完全佐剂等体积混匀，选择7周龄Balb/c雌性小鼠，腹腔注射0.2mL；分别在第14、28d，用弗氏不完全佐剂乳化抗原加强免疫，在第42d断尾采血，分离血清；用间接ELISA方法进行抗体水平检测，对免疫效果较好及抗体效价测定较高的小鼠腹腔注射0.1mL蛋白，第45d无菌取小鼠脾细胞进行融合；(十六)Nigero75/1病毒的制备Vero细胞由本实验室保存；扩大培养的Vero细胞在225cm2细胞瓶里进行传代，同步按照2％接Nigero75/1病毒，37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中培养；每天观察细胞状态，第三天细胞病变明显，反复冻融三次后﹣20℃保存，进行病毒浓缩；500ml的毒液10000rpm离心30min去除细胞碎片；用100KD超滤浓缩离心管6000rpm离心15min；吸取V型管内液体，将离心管内的液体弃之；反复离心多次，最终浓缩的病毒液100ml；将浓缩的毒液分装到2ml离心管内，﹣70℃冻存备用；(十七)间接ELISA单抗筛选检测方法的建立按常规间接ELISA操作步骤，采用方阵法确定抗原最佳包被浓度、抗体的最佳工作浓度及叛定标准；根据阳性血清孔的OD值接近1.0，阴性血清OD值<0.2，P/N>2.1为阳性，同时设立空白对照及SP2/0上清对照；纯化的Nigero75/1病毒作为抗原包被，采用方阵试验进行测定：病毒用包被液做1:1、1:2、1:4、1:8稀释，加入酶标板，100μL/孔，并轻弹或振动平板以使抗原分布均匀；将包被的酶标板用盖封好，4℃过夜，弃去ELISA板中液体，用多道移液器加入洗涤液(PBST溶液)200μL/孔，室温下轻微振摇3min，在布上轻轻拍干，重复洗涤三次；用5％脱脂奶粉封闭液250μL/孔，37℃封闭60min，同样洗涤三次，拍干；小鼠阳性和阴性血清的稀释倍数为1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200，加入酶标板中，100μL/孔，同时设空白对照，37℃作用45min，洗涤三次，拍干；加入1:10000稀释的兔抗鼠IgG，100μL/孔，25℃作用45min，洗涤三次，拍干；加TMB显色液，100μL/孔，25℃作用3‑5min，加入终止液(2M H2SO4溶液)，100μL/孔，在酶标仪上读取OD450nm吸光值；以阳性血清孔的OD值接近1.0，P/N>2.1的抗原血清最大稀释度作为抗原及对照血清的最适工作浓度；最终筛选出纯化的Nigero75/1病毒作为抗原包被最佳浓度为1:8，抗体稀释度为1:800；(十八)细胞融合(十九)、阳性杂交瘤细胞的筛选融合后的细胞第5d更换培养液，采用半换液方式；所用的培养液按培养时间的不同而有所不同，在融合10d内用HAT培养液；第10d以后用HT培养液，三次克隆后用普通完全培养液；杂交瘤细胞长至15d时，即取细胞培养上清100μL，用Nigero75/1病毒包被的间接ELISA方法进行特异性抗体的检测，同时用SP2/0细胞培养上清液作阴性对照；(二十)、杂交瘤细胞的克隆、冻存和复苏(二十一)、单克隆抗体腹水的制备在接种分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞前1周，先给8周龄雌性BALB/c小鼠每只腹腔注射0.5mL降植烷；将培养的杂交瘤细胞从细胞培养瓶中冲洗下来，1000rpm离心5min，再用PBS缓冲液，PH7.2，悬浮离心洗涤1次，台盼蓝染色做活细胞记数后将细胞密度数调至2×106个/mL，每只小鼠腹腔注射0.5mL细胞悬液，含1×106个细胞；接种后注意观察小鼠状态，待7～12d小鼠腹部明显膨大，行动不便时，用酒精棉球消毒下腹部皮肤后，用12号针头刺入腹腔，能见有腹水滴出，用无菌离心管收集，4℃放置过夜，5000rpm离心5min，上清即为腹水，分装、标记，‑70℃保存；间隔2‑3天，待腹水再生积聚后，同法再取，一只小鼠抽取2‑3次。