[发明专利]固定化酶催化法制备D-赤藓酮糖的方法

摘要

本发明公开了一种利用固定化酶连续催化赤藻糖醇制备D‑赤藓酮糖的方法，该方法包括以下步骤：扩增EDH、EuK、LDH、PPK、AP基因，连接质粒并转入细胞，诱导蛋白表达后将细胞破碎离心分离纯化后得到5种酶，将酶固定化；取相应的酶解底物，加入固定化混合酶，反应生成D‑赤藓酮糖‑4‑磷酸，纯化后得到D‑赤藓酮糖‑4‑磷酸钠；将该底物与固定化磷酸水解酶AP反应，最终制得D‑赤藓酮糖。本发明方法利用丁醇糖氧化酶和羟基丙酮激酶的连续反应，实现了廉价的赤藻糖醇到D‑赤藓酮糖‑4‑磷酸的一次性完全转化，进而可以很方便地利用磷酸水解酶脱磷酸生成D‑赤藓酮糖。反应不会生成类似结构的产物，纯度和收率都得到了保证。

主权项

1.一种利用固定化酶连续催化赤藻糖醇制备D‑赤藓酮糖的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）PCR扩增赤藻糖醇氧化酶、赤藓酮糖激酶、乳酸脱氢酶、ATP再生酶、磷酸水解酶基因片段，然后连接到质粒上；再将质粒转入细胞中；（2）将转入了质粒的细胞置于37^oC、含100μM氨苄青霉素的LB液体培养液中进行培养，当细胞增长至对数期后，加入异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷诱导蛋白表达4小时以上，收集细胞；（3）将步骤（2）收集的细胞破碎、离心，在上清液中逐量加入硫酸铵至终浓度为30‑50% W/V，直至有蛋白固体析出；离心收集蛋白，溶解到pH值8.0的Tris缓冲液中，再经G25尺寸排阻柱除盐、经DEAE Seplite FF阴离子交换柱分离，得到纯化的赤藻糖醇氧化酶、赤藓酮糖激酶、乳酸脱氢酶、ATP再生酶、磷酸水解酶液体酶；（4）将赤藻糖醇氧化酶、赤藓酮糖激酶、乳酸脱氢酶与ATP再生酶的纯化混合酶溶解在缓冲液中，随后加入环氧树脂，室温搅拌24小时以上，酶固定在环氧树脂上，过滤出环氧树脂，用清水和缓冲液洗涤，最后在4^oC干燥；磷酸水解酶依同样的步骤单独固定；步骤（4）所述的缓冲液为100mM pH值6.5 ‑ 9.0的磷酸钾溶液；（5）在缓冲液中加入赤藻糖醇、丙酮酸钠、多聚磷酸、三磷酸腺苷二钠盐ATP、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸单钠盐、氯化镁和氯化钾，调节pH 值到8.0，加入赤藻糖醇氧化酶、赤藓酮糖激酶、乳酸脱氢酶与ATP再生酶的固定化混合酶，在25‑40^oC 轻微搅拌反应4小时以上，生成D‑赤藓酮糖‑4‑磷酸；所述的缓冲液是pH值8.0的Tris.HCl溶液；过滤反应液回收环氧树脂及其固定化酶，在滤液中加入草酸钡和两倍滤液体积的乙醇，用于沉淀D‑赤藓酮糖‑4‑磷酸及磷酸腺苷；离心收集沉淀，溶解在pH值小于7的Tris缓冲液中，加入无水硫酸钠析出不溶性硫酸钡；过滤除去不溶性钡盐，并将滤液pH值上调到7.0，上样阴离子交换树脂柱，并以梯度碳酸氢氨水溶液洗脱，碳酸氢氨浓度从0逐渐升至1.0M，未含磷酸基团的有机杂质最先从交换柱中洗脱出来，之后，含单磷酸基团的D‑赤藓酮糖‑4‑磷酸逐渐被洗脱出来，而含多个磷酸基团的ADP/ATP最后洗脱出；收集到的D‑赤藓酮糖‑4‑磷酸最后经G25尺寸排阻柱除盐得到纯化的D‑赤藓酮糖‑4‑磷酸钠；（6）将D‑赤藓酮糖‑4‑磷酸钠、氯化镁溶解在pH值7.0的Tris.HCl溶液中，然后加入固定化磷酸水解酶，在25‑40^oC轻微搅拌反应2小时以上，然后过滤分离环氧树脂及其固定化酶；滤液经过阴离子交换树酯柱层析，含磷酸化合物吸附在树脂上而D‑赤藓酮糖直接流出，最后用G25尺寸排阻柱脱盐得到纯化的D‑赤藓酮糖。